一种通过基因组编辑创制番茄雄性不育材料的方法及应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114592002A(43)申请公布日2022.06.07(21)申请号202210300131.6(22)申请日2022.03.25(71)申请人四川省农业科学院园艺研究所地址610000四川省成都市静居寺路20号(72)发明人杨亮刘欢李菊李志龙海成苗明军常伟(74)专利代理机构成都玖和知识产权代理事务所(普通合伙)51238专利代理师胡琳梅(51)Int.Cl.C12N15/84(2006.01)C12N15/29(2006.01)A01H6/82(2018.01)A01H5/00(2018.01)A01H1/02(2006.01)权利要求书2页说明书5页序列表3页附图2页(54)发明名称一种通过基因组编辑创制番茄雄性不育材料的方法及应用(57)摘要本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过基因组编辑创制番茄雄性不育材料的方法及应用，本发明公开了一种通过基因组编辑创制番茄雄性不育材料的方法，包括以下步骤：利用CRISPR/Cas9技术对Solyc02g084630基因进行编辑，使Solyc02g084630基因功能丧失，得到番茄雄性不育材料，所述Solyc02g084630基因的序列如SEQIDNO.1所示。本发明得到的番茄雄性不育材料育性稳定，可以创制不同遗传背景的雄性不育系，从而可以应用于杂交育种和制种。CN114592002ACN114592002A权利要求书1/2页1.一种通过基因组编辑创制番茄雄性不育材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用CRISPR/Cas9技术对Solyc02g084630基因进行编辑，使Solyc02g084630基因功能丧失，得到番茄雄性不育材料，所述Solyc02g084630基因的序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9技术中的gRNA靶位点选择在Solyc02g084630基因的第一外显子区域，选取原型间隔序列毗邻基序上游19‑20bp碱基长度，所述Solyc02g084630基因的第一外显子区域的序列如SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述gRNA靶位点的序列包括Target1和/或Target2，所述Target1、Target2序列如下：Target1:5’‑TGAAAACTCGACAAACAGGC‑3’；Target2:5’‑TCATCATGCTATCAAGCACC‑3’。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术对Solyc02g084630基因进行编辑使Solyc02g084630基因功能丧失的方法为：利用CRISPR/Cas9技术使Solyc02g084630基因形成DNA双链断裂位点，利用植物自身对DBS的修复机制，在断裂位点引入插入、缺失或替换，导致Solyc02g084630基因的功能丧失。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9技术对Solyc02g084630基因进行编辑的方法步骤包括：S1、根据识别序列设计oligo序列引物，所述引物包括Target1‑F和/或Target2‑F，所述Target1‑F为5’‑atatatggtctcgattgN19‑20gttttagagctagaaatag‑3’，所述Target2‑F为5’‑attattggtctcgaaacN19‑20caatctcttagtcgactct‑3’，其中，N19‑20代表19‑20bp碱基的识别序列；S2、以中间载体pCBC‑DT1T2为模板，加入所述oligo序列引物，用高保真酶进行PCR扩增，回收PCR产物；S3、将pKSE401载体及所述PCR产物用BsaI内切酶进行酶切，酶切产物回收后，按照载体：片段＝1:7(摩尔比)进行混合，通过T4DNA连接酶进行连接反应；S4、将连接后的载体转入大肠杆菌感受态，挑取单克隆进行菌体PCR，菌体PCR所用引物序列如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示；S5、将菌体PCR结果鉴定为阳性的质粒进行测序分析，将测序正确的质粒，转入农杆菌GV3101感受态，并进行菌体PCR，得到包含正确质粒的阳性农杆菌；S6、以番茄子叶为外植体，通过叶盘转化法进行阳性农杆菌GV3101介导的遗传转化，经过卡那霉素抗性筛选，获得再生植株。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9技术对Solyc02g084630基因进行编辑的方法还包括：S7、根据Cas9序列设计引物，提取再生植株基因组DNA，并以此为模板进行PCR扩增，进行转基因阳性株系的检测；S8、根据靶位点上下游序列设计引物，以转基因阳性株系基因组DNA为模板进行PC