一株H9N2亚型禽流感病毒MDCK细胞冷适应减毒活疫苗株及其培育方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114836390A(43)申请公布日2022.08.02(21)申请号202210660247.0A61K39/145(2006.01)(22)申请日2022.06.13A61P31/16(2006.01)C12R1/93(2006.01)(83)生物保藏信息CCTCCNO:V2022402022.05.22(71)申请人华南农业大学地址510642广东省广州市天河区五山路483号(72)发明人孙海亮潘亮奇廖明(74)专利代理机构北京盛询知识产权代理有限公司11901专利代理师相凡(51)Int.Cl.C12N7/00(2006.01)C12N7/04(2006.01)权利要求书1页说明书12页C12N5/071(2010.01)序列表8页附图4页(54)发明名称一株H9N2亚型禽流感病毒MDCK细胞冷适应减毒活疫苗株及其培育方法和应用(57)摘要本发明公开了一株H9N2亚型禽流感病毒MDCK细胞冷适应减毒活疫苗株及其培育方法和应用，属于兽用药物领域。所述冷适应减毒疫苗株保藏编号为CCTCCNO:V202240。所述冷适应减毒活疫苗株的培育方法，包括：以一株H9N2亚型禽流感流行毒株作为亲本毒株，在MDCK细胞中梯度降温培育获得冷适应减毒活疫苗株。本发明公开的冷适应减毒活疫苗株的培育方法可以摆脱对鸡胚的依赖，而且所培育的冷适应减毒活疫苗株可以刺激机体产生体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫，从而保护家禽不受H9N2禽流感病毒的侵扰。CN114836390ACN114836390A权利要求书1/1页1.一株H9N2亚型禽流感病毒MDCK细胞冷适应减毒活疫苗株，其特征在于，所述冷适应减毒疫苗株保藏编号为CCTCCNO:V202240。2.如权利要求1所述的一株H9N2亚型禽流感病毒MDCK细胞冷适应减毒活疫苗株的培育方法，其特征在于，包括：以一株H9N2亚型禽流感流行毒株作为亲本毒株，在MDCK细胞中梯度降温培育获得冷适应减毒活疫苗株。3.如权利要求2所述的培育方法，其特征在于，所述亲本毒株为H9N2亚型禽流感流行毒株CK141/20。4.如权利要求2所述的培育方法，其特征在于，所述在MDCK细胞中梯度降温培育，包括以下步骤：(1)将单层MDCK细胞接种亲本毒株CK141/20，33±0.5℃，5％CO2恒温培养，收获初始病毒液，将所收获的初始病毒液反复冻融，并选择HA效价高的病毒液进行连续传代10代，病毒能够在33±0.5℃进行稳定地传代，收获33±0.5℃温度下的病毒液；(2)依次采用30±0.5℃、28±0.5℃、26±0.5℃的培养温度，重复上述(1)的步骤，收获26±0.5℃温度下的病毒液；(3)将步骤(2)收获的26±0.5℃温度下的病毒液，置于25℃，5％CO2恒温培养，再经有限稀释法纯化5‑10代，收集好纯化的病毒液，即得所述的H9N2亚型禽流感病毒MDCK细胞冷适应减毒活疫苗株。5.如权利要求4所述的培育方法，其特征在于，在培养病毒过程中，所用的病毒维持液为：以体积比为1:1混合的DMEM和DMEM/F12培养基为基础培养基，添加终浓度为1.0mg/mL牛血清白蛋白溶液、100units/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、0.5‑1.5μg/mL谷氨酰胺溶液和0.5‑1.5μg/mLTPCK‑胰酶。6.如权利要求1所述的一株H9N2亚型禽流感病毒MDCK细胞冷适应减毒活疫苗株在预防和控制H9N2亚型禽流感的疫苗研究和制备中的应用。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述冷适应减毒活疫苗株应用于鸡H9N2亚型禽流感的预防和控制中。2CN114836390A说明书1/12页一株H9N2亚型禽流感病毒MDCK细胞冷适应减毒活疫苗株及其培育方法和应用技术领域[0001]本发明涉及兽用药物领域，特别是涉及一株H9N2亚型禽流感病毒MDCK细胞冷适应减毒活疫苗株及其培育方法和应用。背景技术[0002]禽流感是由禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus，AIV)引起的禽类高发性疾病，以精神沉郁、食欲减退、咳嗽和喷嚏等呼吸道症状为主要临床症状，是一种高发性、烈性和高度接触性的传染性疾病。H9N2禽流感病毒宿主要包括：水禽、野鸟和家禽(如：火鸡、鸡、鸭子等)。低致病性禽流感H9N2感染鸡群一般不会直接导致鸡的死亡，但会导致产蛋率下降以及生长迟缓，给养禽业造成巨大的经济损失。[0003]中国H9N2禽流感病毒于1994年在广东省广州市首次被发现。家禽感染H9N2亚型禽流感的临床症状表现为产蛋量下降和一定的死亡率，并且可造成水平传播。因为禽流感病毒变异和重组非常快，及时发现新型毒株，研究其抗原性和免疫原性，筛选出疫苗候选毒株是保证禽流感疫苗效果的最重要方式之一。