一种快速创制纯合超甜玉米种质的方法及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114916432A(43)申请公布日2022.08.19(21)申请号202210129695.8(51)Int.Cl.(22)申请日2022.02.11A01H1/02(2006.01)A01H1/04(2006.01)(71)申请人中国农业科学院作物科学研究所C12N15/82(2006.01)地址100000北京市海淀区中关村南大街C12N15/65(2006.01)12号，中国农业科学院作物科学研究C12N15/54(2006.01)所，育种南楼606申请人广东省农业科学院作物研究所(72)发明人朱金洁谢传晓李丽娜祁显涛刘昌林胡建广李高科徐孝洁黄晶(74)专利代理机构北京慕达星云知识产权代理事务所(特殊普通合伙)11465专利代理师崔自京权利要求书2页说明书5页附图6页(54)发明名称一种快速创制纯合超甜玉米种质的方法及其应用(57)摘要本发明公开了一种快速创制纯合超甜玉米种质的方法及其应用。属于玉米改良技术领域。本发明目的在于提供不依赖于基因型快速改良ZmSh2位点的育种技术，能够在两个世代内将任意玉米品种改良为超甜品系。本发明创制了配套双荧光单倍体筛选系统的玉米单倍体诱导(ZmMTL及ZmDMP双基因突变纯合体)系，并进一步复合Sh2基因编辑CRISPR‑Cas9元件，形成单倍体诱导版Sh2基因编辑系，实现单倍体诱导的同时改良玉米超甜性状。将被改良材料做母本与单倍体诱导基因编辑系杂交，通过双荧光系统筛选获得孤雌生殖单倍体，进一步通过基因型鉴定获得超甜单倍体，然后利用染色体加倍技术，获得双单倍体自交即可获得目标改良材料。CN114916432ACN114916432A权利要求书1/2页1.一种快速创制超甜玉米种质的方法，其特征在于，包括：利用mtl和dmp突变纯合体且Shrunken2‑CRISPR/Cas9和DFP转基因元件纯合的玉米Shrunken2基因编辑单倍体玉米诱导系进行和玉米自交系进行杂交，杂交后代经单倍体筛选与鉴定，获得的单倍体诱导系通过染色体加倍，获得超甜性性状改良的双单倍玉米种质。2.如权利要求1所述的一种快速创制超甜玉米种质的方法，其特征在于，所述mtl和dmp突变纯合体且Shrunken2‑CRISPR/Cas9和DFP转基因元件纯合的玉米Shrunken2基因编辑单倍体玉米诱导系的制备包括以下步骤：(1)将eGFP‑HvASP：DsRED双荧光表达载体导入受体材料，筛选得到DFP阳性材料；(2)将Shrunken2‑CRISPR/Cas9编辑载体导入受体材料，筛选得到Shrunken2‑CRISPR/Cas9阳性材料；(3)将mtl和dmp双基因突变材料与步骤(1)得到的所述DFP阳性材料杂交获得杂交聚合mtl、dmp突变和DEP元件材料；(4)将杂交聚合mtl、dmp突变和DEP元件材料与步骤(2)得到的所述Shrunken2‑CRISPR/Cas9阳性材料杂交获得所述mtl和dmp突变纯合体且Shrunken2‑CRISPR/Cas9和DFP转基因元件纯合的玉米Shrunken2基因编辑单倍体玉米诱导系。3.如权利要求2所述的一种快速创制超甜玉米种质的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中所述受体材料均为玉米X249。4.如权利要求2所述的一种快速创制超甜玉米种质的方法，其特征在于，步骤(1)中所述筛选通过BAR试纸条进行。5.如权利要求1所述的一种快速创制超甜玉米种质的方法，其特征在于，所述玉米自交系为B73、159F或159M。6.如权利要求1所述的一种快速创制超甜玉米种质的方法，其特征在于，所述超甜性性状改良的双单倍玉米种质通过单倍体鉴定方法获得，所述单倍体鉴定方法包括幼胚水平、成熟籽粒及萌发幼苗的下胚轴观察的单倍体鉴定方法；所述幼胚水平观察的单倍体鉴定方法为：用520nm的激发光观察籽粒荧光，排除其他花粉授粉导致的胚乳没有红色荧光的种子，然后用488nm的激发光观察胚部的绿色荧光，其中表达绿色荧光的是二倍体，没有绿色荧光的是单倍体；所述成熟籽粒观察的单倍体鉴定方法为：用520nm的激发光观察籽粒红色荧光，排除其他花粉授粉导致的胚乳没有红色荧光的种子，然后用488nm的激发光观察胚部的绿色荧光，其中表达绿色荧光的是二倍体，没有绿色荧光的是单倍体；所述萌发幼苗下胚轴观察的单倍体鉴定方法为：取收获后果穗进行脱粒，浸泡过夜后，置于石英砂中进行萌发，取萌发2d种子，用520nm的激发光观察籽粒红色荧光，排除其他花粉授粉导致的胚乳没有红色荧光的种子，然后用488nm的激发光观察下胚轴的绿色荧光，其中表达绿色荧光的是二倍体，没有绿色荧光的是单倍体。7.权利要求1～6任一所述的方法在培育玉米新品种中的应用。8.mtl和dmp突变