表达荧光报告基因的芽孢杆菌属质粒.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114945581A(43)申请公布日2022.08.26(21)申请号202180009544.2(74)专利代理机构北京市金杜律师事务所(22)申请日2021.01.1511256专利代理师邰红(30)优先权数据62/962,0332020.01.16US(51)Int.Cl.C07K14/32(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日C12N1/20(2006.01)2022.07.15C12N15/62(2006.01)(86)PCT国际申请的申请数据PCT/US2021/0135292021.01.15(87)PCT国际申请的公布数据WO2021/146492EN2021.07.22(71)申请人诺维信生物农业公司地址丹麦鲍斯韦(72)发明人J·赫弗伦J·W·里斯权利要求书2页说明书17页序列表91页附图9页(54)发明名称表达荧光报告基因的芽孢杆菌属质粒(57)摘要本发明涉及用于使芽孢杆菌属菌株发出荧光的荧光报告基因质粒系统，以及用于对芽孢杆菌属菌株的状态进行可视化的方法。CN114945581ACN114945581A权利要求书1/2页1.一种荧光报告基因质粒系统，该荧光报告基因质粒系统用于使芽孢杆菌属菌株发出荧光，其中该芽孢杆菌属菌株在其休眠芽孢状态和/或在其代谢活性营养状态下发出荧光，并且其中将该质粒系统设计为在染色体外发挥功能。2.如权利要求1所述的质粒系统，将该质粒转化至芽孢杆菌属细胞后，该质粒系统使芽孢杆菌属菌株发出荧光，其中该芽孢杆菌属菌株在其休眠芽孢状态和/或在其代谢活性营养状态下发出荧光。3.如权利要求1至2中任一项所述的质粒系统，其中该芽孢杆菌属菌株在其休眠芽孢状态时发出第一荧光颜色的荧光，并且在其代谢活性营养状态时发出第二荧光颜色的荧光，并且其中该第一荧光颜色不同于该第二荧光颜色。4.如权利要求1至3中任一项所述的质粒系统，该质粒系统包含编码荧光蛋白的一种或多种报告基因。5.如权利要求4所述的质粒系统，其中由该报告基因编码的荧光蛋白选自由以下组成的组：绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)、DsRedexpress2、mCherry、mOrange、mPlum黄色荧光蛋白(EYFP)、青色荧光蛋白(ECFP)、以及Sapphire。6.如权利要求1至5中任一项所述的质粒系统，其中该报告基因在该休眠芽孢中表达。7.如权利要求1至6中任一项所述的质粒系统，其中将该报告基因翻译融合至编码小的酸溶性蛋白(SASP)的基因。8.如权利要求1至7中任一项所述的质粒系统，其中编码1至24个氨基酸，如编码6至20个氨基酸、8至20个氨基酸、8至16个氨基酸、9至15个氨基酸、10至14个氨基酸、或11至13个氨基酸的接头位于该报告基因和该编码SASP的基因之间。9.如权利要求8所述的质粒系统，将该质粒系统翻译为SASP蛋白和荧光蛋白融合物。10.如权利要求1至9中任一项所述的质粒系统，其中该报告基因是第一报告基因，并且该质粒系统进一步包含第二报告基因，其中该第二报告基因编码荧光蛋白，该荧光蛋白不同于由该第一报告基因编码的荧光蛋白。11.如权利要求10所述的质粒系统，其中该第一报告基因编码荧光蛋白，将该荧光蛋白设计为在其休眠芽孢状态下发出荧光，并且该第二报告基因编码荧光蛋白，将该荧光蛋白设计为在其代谢活性营养状态下发出荧光。12.如权利要求1至11中任一项所述的质粒系统，其中该启动子区域包含一种或多种在营养生长期间表达的启动子。13.如权利要求1至12中任一项所述的质粒系统，其中该芽孢杆菌属菌株选自由以下组成的组：巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、单纯芽孢杆菌、冷解糖芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌。14.一种对芽孢杆菌属菌株在动物、植物或植物种子中的状态进行可视化的方法，该方法包括：a)将芽孢杆菌属菌株和包含单或双报告基因质粒系统的细胞组合，用于使该芽孢杆菌属菌株在休眠芽孢状态时发出一种荧光颜色的荧光，和/或在代谢活性营养状态时发出另一种荧光颜色的荧光，b)用步骤(a)的芽孢杆菌属菌株处理动物或植物种子，c)从步骤(b)的经处理的动物或植物种子中收集样品，2CN114945581A权利要求书2/2页d)任选地用DNA染料染色步骤(c)的样品，以及e)将步骤(c)或(d)的样品成像以对该芽孢杆菌属菌株的状态进行可视化。15.一种对芽孢杆菌属菌株在体外或体内的状态进行可视化的方法，其中使用如权利要求1至13中任一项所述的质粒系统使这些芽孢杆菌属菌株在休眠芽孢状态和/或代谢活性营养状态下发出荧光，其中这些芽孢杆菌属菌株的荧光表明该菌株的状态。3CN1149455