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(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115074334A(43)申请公布日2022.09.20(21)申请号202110277431.2(74)专利代理机构北京华夏正合知识产权代理(22)申请日2021.03.15事务所(普通合伙)11017专利代理师韩登营(83)生物保藏信息CCTCCNO.V2020972020.12.16(51)Int.Cl.C12N7/00(2006.01)(71)申请人夏津新希望六和农牧有限公司C07K14/165(2006.01)地址253211山东省德州市夏津县苏留庄A61K39/215(2006.01)镇郭寨林场A61K39/39(2006.01)申请人洛阳惠中生物技术有限公司A61P31/14(2006.01)新希望六和股份有限公司C12R1/93(2006.01)山东新希望六和集团有限公司青岛嘉智生物技术有限公司闫之春李孝文(72)发明人李孝文颜忠宋国亮王坤邵振文李洋闫之春李军现樊铭玉权利要求书1页说明书7页序列表3页(54)发明名称猪流行性腹泻病毒株、扩增培养方法、及其制备的疫苗组合物、制备方法和应用(57)摘要本发明提供了一种具有良好免疫原性的现有流行株,猪流行性腹泻病毒NH‑TA2020株,其制备的疫苗组合物能在低免疫量时提供针对现有流行野毒株的免疫保护。本发明还提供了扩增培养该毒株的方法,先通过胰蛋白酶孵育,然后在细胞维持液中添加柠檬酸,使得培养的病毒滴度提高2个数量级以上。本发明还提供了制备疫苗组合物的方法。CN115074334ACN115074334A权利要求书1/1页1.猪流行性腹泻病毒NH‑TA2020株,保藏编号为:CCTCCNO.V202097。2.一种扩增培养权利要求1所述猪流行性腹泻病毒NH‑TA2020株的方法,其中,所述方法包括:步骤(1)向形成有单层传代细胞的培养容器内加入胰蛋白酶和细胞维持液,放置细胞培养箱中孵育3分钟并弃去,其中胰蛋白酶的用量为细胞维持液体积用量的0.05%V/V;步骤(2)将所述猪流行性腹泻病毒NH‑TA2020株接种于所述步骤(1)胰蛋白酶孵育后的单层的传代细胞,吸附;步骤(3)在所述步骤(2)的所述吸附了猪流行性腹泻病毒NH‑TA2020株的传代细胞中加入3%W/V柠檬酸和细胞维持液,其中柠檬酸的用量为细胞维持液体积用量的0.1%V/V,扩增培养所述猪流行性腹泻病毒NH‑TA2020株;以及步骤(4)当所述步骤(3)的所述的传代细胞CPE达到80%以上时,收获所述扩增培养的猪流行性腹泻病毒NH‑TA2020株。3.根据权利要求2所述的方法,其中,所述步骤(1)的所述传代细胞为Vero细胞;所述细胞维持液为含有1%v/v胎牛血清的99%v/vDMEM。4.一种含有猪流行性腹泻病毒抗原的疫苗组合物的制备方法,其中,所述制备方法包括:步骤(1)制备铝胶佐剂组合物,将5%w/v硫酸铝溶液和5%w/v氢氧化钠溶液按体积比2.5:1搅拌混合,待生成铝胶沉淀后,离心分离所述铝胶,用生理盐水洗涤所述分离的铝胶,然后用与硫酸铝溶液的等体积的生理盐水悬浮所述洗涤的铝胶,在所述悬浮的铝胶中依次加入聚丙烯酸和硫酸葡聚糖,使其终浓度分别为聚丙烯酸2mg/ml,硫酸葡聚糖0.4mg/ml,搅拌均匀,得到佐剂组合物,均质所述佐剂组合物,得到所述铝胶佐剂组合物;步骤(2)灭活权利要求2所述扩增培养方法扩增培养的猪流行性腹泻病毒NH‑TA2020株,得到猪流行性腹泻病毒NH‑TA2020株灭活全病毒抗原;以及步骤(3)将所述步骤(1)的所述铝胶佐剂组合物和所述步骤(2)的所述猪流行性腹泻病毒NH‑TA2020株灭活全病毒抗原按1:9混合,乳化,得到所述疫苗组合物。5.根据权利要求4所述的制备方法,其中,所述步骤(1)制备铝胶佐剂组合物中所述搅拌速率为500转/分钟;所述均质条件为均质机800bar、50℃均质4次;以及所述步骤(2)中所述灭活使用β‑丙内酯进行灭活。6.根据权利要求4~5任一项所述制备方法制备的含有猪流行性腹泻病毒抗原的疫苗组合物,其中,所述疫苗组合物中所述猪流行性腹泻病毒NH‑TA2020株灭活全病毒抗原含量6.0为灭活前≥10TCID50/ml。7.根据权利要求6所述的疫苗组合物,其中,所述疫苗组合物中所述猪流行性腹泻病毒6.07.0NH‑TA2020株灭活全病毒抗原含量为灭活前10~10TCID50/ml。8.根据权利要求6~7任一项所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。9.猪流行性腹泻病毒S蛋白,其如SEQIDNo.1或其简并序列编码。2CN115074334A说明书1/7页猪流行性腹泻病毒株、扩增培养方法、及其制备的疫苗组合物、制备方法和应用技术领域[0001]本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒