一种改进的浸花法转化播娘蒿的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115094086A(43)申请公布日2022.09.23(21)申请号202210683720.7(22)申请日2022.06.17(71)申请人江西省、中国科学院庐山植物园地址332999江西省九江市庐山植青路9号(72)发明人刘毅贾天娇张涛周定定孔丹宇(74)专利代理机构天津耀达律师事务所12223专利代理师侯力(51)Int.Cl.C12N15/84(2006.01)C12N15/65(2006.01)A01H5/00(2018.01)A01H6/20(2018.01)权利要求书1页说明书4页附图4页(54)发明名称一种改进的浸花法转化播娘蒿的方法(57)摘要一种改进的浸花法转化播娘蒿的方法，将待转化的播娘蒿花序浸泡于含有悬浮农杆菌的渗透培养基中，然后及时吸干花序上多余的渗透培养基，可避免花序死亡，大大提高转化成功率。将转化植株获得的T1种子在含有羧苄青霉素钠的1/2MS培养基上进行筛选，能有效抑制农杆菌的生长，保证筛选的有效性，获得转基因植株。该方法操作简单有效，实验周期短，可快速获得转基因播娘蒿，从种子到获得T1转基因植株仅需要2‑3个月的时间。本发明的方法为播娘蒿的基因导入或敲除等功能研究提供技术支持，为播娘蒿重要基因的功能解析提供参考。CN115094086ACN115094086A权利要求书1/1页1.一种改进的浸花法转化播娘蒿的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将含有目的基因及抗性筛选基因的重组表达载体导入农杆菌中，并用渗透培养基悬浮；(2)利用浸花法进行转化：将播娘蒿花序浸泡于所述含有悬浮农杆菌的渗透培养基中；(3)用滤纸将所述播娘蒿花序上多余的渗透培养基吸干；(4)将侵染后的播娘蒿植株经过暗处理后正常培养至结种；(5)将步骤(4)中转化后的植株采取单株收种，得到T1代种子，将所述种子在含有抗生素的1/2MS培养基上萌发培育，筛选得到具有抗性的植株；(6)通过进一步检测目的基因确认抗性植株是否转化成功。2.根据权利要求1所述的改进的浸花法转化播娘蒿的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的农杆菌菌株为GV3101。3.根据权利要求1所述的改进的浸花法转化播娘蒿的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的渗透培养基包含表面活性剂SilwetL‑77和蔗糖。4.根据权利要求3所述的改进的浸花法转化播娘蒿的方法，其特征在于，所述的表面活性剂SilwetL‑77的浓度为100‑500μL/L。5.根据权利要求3所述的改进的浸花法转化播娘蒿的方法，其特征在于，所述的蔗糖的浓度为50‑60g/L。6.根据权利要求1所述的改进的浸花法转化播娘蒿的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的含有悬浮农杆菌的渗透培养基OD600值为0.6‑0.8。7.根据权利要求1所述的改进的浸花法转化播娘蒿的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的播娘蒿花序浸泡时间为45‑60秒。8.根据权利要求1所述的改进的浸花法转化播娘蒿的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的侵染的播娘蒿植株暗处理时间为10‑12小时。9.根据权利要求1所述的改进的浸花法转化播娘蒿的方法，其特征在于，步骤(5)中所述的抗生素包含羧苄青霉素钠及表达载体所含的筛选基因抗生素。10.根据权利要求1所述的改进的浸花法转化播娘蒿的方法，其特征在于，步骤(5)中所述的抗生素的使用浓度为50‑100mg/L。2CN115094086A说明书1/4页一种改进的浸花法转化播娘蒿的方法技术领域[0001]本发明属于植物基因工程领域，涉及一种改进的浸花法转化播娘蒿的方法。背景技术[0002]播娘蒿[Descurainiasophia(L.)]属十字花科一年生或越年生药用草本植物，主要分布于东北、河北、内蒙古、山东、河南、浙江、甘肃等地。播娘蒿干燥成熟的种子称为南葶苈子，味辛、苦，性大寒，具有止咳平喘、消肿利尿、强心之功效，临床应用十分广泛。化学成分研究表明，南葶苈子中含有槲皮素、山柰素、异鼠李素以及它们的苷等黄酮类化合物，均与南葶苈子止咳化痰、泻肺平喘，治疗各种类型心衰等多方面临床疗效密切相关，是南葶苈子中重要的有效成分。[0003]当前遗传转化技术发展迅速，并全面推动了育种技术的升级，已在多种药用植物品种创新中发挥了重要作用，比如枸杞，黄芪等。目前，药用植物主要依赖叶片、下胚轴等外植体进行遗传转化并获得转基因株系，但这种遗传转化体系在操作上比较复杂和耗时，因为要经过组织培养和植株再生过程，该过程需要数月的时间且操作繁琐，受到很多因素和培养条件的限制，可能会产生的对植物基因型的依赖和各种无法预测的体细胞变异对后代的不利影响。浸花法转化是利用植物材料花序与农杆菌接触，在活体条件下完成可遗传细胞的转化，并通过对后代的筛选获得转化株系，已成功应用于