一种非组培方式的不结球白菜再生方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115216490A(43)申请公布日2022.10.21(21)申请号202211006214.0A01H5/00(2018.01)(22)申请日2022.08.22A01H6/20(2018.01)A01H4/00(2006.01)(71)申请人江苏省农业科学院地址210014江苏省南京市玄武区钟灵街50号(72)发明人刘之洋刘静宁宇徐海陈龙正晋晨夏彭飞袁希汉(74)专利代理机构北京汇捷知识产权代理事务所(普通合伙)11531专利代理师李鑫(51)Int.Cl.C12N15/84(2006.01)C12N15/89(2006.01)C12N15/82(2006.01)C12N15/29(2006.01)权利要求书1页说明书3页附图2页(54)发明名称一种非组培方式的不结球白菜再生方法(57)摘要本发明公开了一种非组培方式的不结球白菜再生方法，该方法包括以下步骤：将经过催芽处理的不结球白菜种子置于穴盘内生长；在幼苗长至子叶展开期或两叶一心期时，将幼苗顶端分生组织用新刀片切去，确保子叶一并切去，仅留有下胚轴，将农杆菌悬浮液用微量注射器注射至幼苗伤口处；悬浮液的农杆菌细胞中含有pMKV057双元质粒载体；将蘸有农杆菌悬浮液的脱脂棉球置于幼苗伤口处保湿，黑暗条件下放置两天后取下脱脂棉球，将幼苗继续培养得到再生植株。本发明方法避免了传统方法中的从愈伤组织经脱分化、再分化形成再生芽的阶段，为后续利用非组培方式对遗传转化顽拗型蔬菜作物进行基因编辑提供了新的解决思路。CN115216490ACN115216490A权利要求书1/1页1.一种非组培方式的不结球白菜再生方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)将经过催芽处理的不结球白菜种子置于穴盘内生长；(2)在幼苗长至子叶展开期或两叶一心期时，将幼苗顶端分生组织用新刀片切去，确保子叶一并切去，仅留有下胚轴，将农杆菌悬浮液用微量注射器注射至幼苗伤口处；其中，所述悬浮液的农杆菌细胞中含有pMKV057双元质粒载体，该pMKV057双元质粒载体上含有编码生长调节因子的基因；(3)将蘸有所述农杆菌悬浮液的脱脂棉球置于幼苗伤口处保湿，黑暗条件下放置两天后取下脱脂棉球，将幼苗在光周期为16小时光照/8小时黑暗、25℃～28℃温度的条件下继续培养，得到再生植株。2.如权利要求1所述的非组培方式的不结球白菜再生方法，其特征在于，所述农杆菌悬浮液的OD600＝0.8。3.如权利要求1所述的非组培方式的不结球白菜再生方法，其特征在于，所述生长调节因子为WUS和IPT。2CN115216490A说明书1/3页一种非组培方式的不结球白菜再生方法技术领域[0001]本发明属于植物再生技术领域，尤其涉及一种非组培方式的不结球白菜再生方法。背景技术[0002]遗传转化技术在作物性状改良上发挥了重要作用，改良的优异性状包括产量、品质、生物和非生物胁迫抗性等方面。其中，基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术因具有操作简便、编辑效率高、支持多靶点编辑、编辑形式多样等优势，成为作物遗传改良的新兴技术，已在许多作物性状改良上发挥了重要作用，但是该方法是基于组织培养的遗传转化方法，过程严重依赖于作物的再生和转化体系。对于遗传转化体系较为成熟的作物，如小麦、水稻、番茄等，基因编辑技术应用相对容易实现。然而，对于大多数蔬菜作物而言，遗传转化体系并不成熟，这也成为限制CRISPR/Cas9基因编辑技术在蔬菜作物上应用的关键瓶颈问题。蔬菜作物中从外植体中诱导分化形成再生芽过程非常困难，受基因型、外植体状态、培养基类型、生长调节剂类型及含量、培养环境等诸多因素影响，或者T‑DNA系统转化插入受体基因组的效率极低。因此，建立非组培方式的遗传转化体系是实现蔬菜基因编辑的关键环节，亟待实现技术突破。发明内容[0003]为克服现有技术的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种非组培方式的不结球白菜再生方法。[0004]本发明是这样实现的，一种非组培方式的不结球白菜再生方法，该方法包括以下步骤：[0005](1)将经过催芽处理的不结球白菜种子置于穴盘内生长；[0006](2)在幼苗长至子叶展开期或两叶一心期时，将幼苗顶端分生组织用新刀片切去，确保子叶一并切去，仅留有下胚轴，将农杆菌悬浮液用微量注射器注射至幼苗伤口处；其中，所述悬浮液的农杆菌细胞中含有pMKV057双元质粒载体，该pMKV057双元质粒载体上含有编码生长调节因子的基因；[0007](3)将蘸有所述农杆菌悬浮液的脱脂棉球置于幼苗伤口处保湿，黑暗条件下放置两天后取下脱脂棉球，将幼苗在光周期为16小时光照/8小时黑暗、25℃～28℃温度的条件下继续培养，得到再生植株。[0008]优选地，所述农杆菌悬浮液的OD600＝0.8。[0