H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗及制备方法与应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115252770A(43)申请公布日2022.11.01(21)申请号202210732622.8C12N15/63(2006.01)(22)申请日2022.06.27C12N15/11(2006.01)(71)申请人北京农学院地址102208北京市昌平区回龙观镇北农路7号(72)发明人阮文科张博文徐胜奎姚劼林夏婷(74)专利代理机构西安铭泽知识产权代理事务所(普通合伙)61223专利代理师崔瑞迎(51)Int.Cl.A61K39/145(2006.01)A61P31/16(2006.01)C07K14/11(2006.01)C12N15/44(2006.01)权利要求书1页说明书8页序列表5页附图9页(54)发明名称H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗及制备方法与应用(57)摘要本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗及制备方法与应用。具体涉及H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗的制备和安全性和免疫效力的评估。本发明所述H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗安全有效，可以在SPF鸡体内诱发强烈的体液免疫以及细胞免疫应答，作为一种新型疫苗在应对H9N2禽流感疫情时有良好的前景。CN115252770ACN115252770A权利要求书1/1页1.一种H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗的制备方法，其特征在于，包括：以H9N2亚型禽流感病毒HA全长为模板，经过PCR扩增得到扩增产物；扩增产物连接入pVAX1质粒，构建了pVAX1‑HA重组质粒；反向PCR线性化重组质粒，带有T7启动子的线性化质粒在T7RNA聚合酶作用下体外转录后得到目的片段mRNA；通过牛痘病毒加帽系统和Poly(A)聚合酶进行mRNA修饰，得到mRNA疫苗。2.根据权利要求1所述的H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗的制备方法，其特征在于，PCR扩增所用引物为：上游引物H9N2HAp1：5’‑GGGAGACCCAAGCTGGCTAGCATGGAAGTAGCATCACTAATAACTATACT‑3’；下游引物H9N2HAp2：5’‑TCCGAGCTCGGTACCAAGCTTTTATATACAAATGTTGCATCTGCAAGC‑3’。3.根据权利要求1所述的H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗的制备方法，其特征在于，pVAX1质粒以及重组质粒酶切位点均是NheⅠ、HindⅢ；反向PCR得到线性化质粒的引物序列如下：pVAX1‑HAp1：5’‑TTATATACAAATGTTGCATCTGCAAGA‑3’；pVAX1‑HAp2：5’‑ATGGAAGTAGCATCACTAATAACTATACTACTAG‑3’。4.根据权利要求1所述的H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗的制备方法，其特征在于，将纳米脂质体与修饰后的mRNA自组装后制备成粒子形态的mRNA疫苗。5.根据权利要求1‑4任一项所述的制备的H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗。6.一种针对H9N2亚型禽流感病毒的mRNA疫苗的抗原，其特征在于，所述抗原是HA原核蛋白，其抗原氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。7.一种用于制备针对H9N2亚型禽流感病毒的疫苗的mRNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。8.一种与权利要求7所述的mRNA互补的DNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。9.一种包含权利要求7所述的mRNA的载体。10.一种权利要求7所述的mRNA在制备针对H9N2亚型禽流感病毒的疫苗中的应用。2CN115252770A说明书1/8页H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗及制备方法与应用技术领域[0001]本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗及制备方法与应用。背景技术[0002]流感病毒为多节段单股负链有囊膜的RNA病毒，流感病毒可根据核蛋白和基质蛋白的抗原性差异分为A，B，C三种型，H9N2亚型禽流感病毒属于A型流感病毒，病毒粒子由核衣壳和病毒囊膜构成。在亚洲的禽类中广泛传播，病理表现为轻微的呼吸道症状，引发继发感染后会感染导致死亡。[0003]A型流感病毒基因组按照基因长度由PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS这8个负链和单链RNA片段组成，每种病毒基因至少编码一种蛋白。HA是一种三聚体形式的吸附蛋白，C端末端的一个疏水区插入病毒囊膜中，是血凝素蛋白与病毒囊膜结合的部位，N端末端的一个疏水区有膜融合活性，与病毒入侵宿主细胞有关，还会诱导中和抗体产生和细胞免疫，是病毒表面的主要抗原之一。而灭活疫苗主要诱导体液免疫，细胞免疫较弱，随着H9N2病毒的不断变异，在各个国家都出现了疫苗接种失效的情况。[0004]mRNA疫苗是一种将RNA在体外进行