一种生物活性次级代谢产物的制备方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115323027A(43)申请公布日2022.11.11(21)申请号202211087399.2C12R1/645(2006.01)(22)申请日2022.09.07(71)申请人福建农林大学地址350002福建省福州市仓山区上下店路15号(72)发明人邱君志朱志强谭震刘森陈宇熹蒲慧丽杨晨杰陈金慧赖芃宇王玲(74)专利代理机构福州元创专利商标代理有限公司35100专利代理师林文弘蔡学俊(51)Int.Cl.C12P33/00(2006.01)C07J63/00(2006.01)A61P35/00(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图6页(54)发明名称一种生物活性次级代谢产物的制备方法和应用(57)摘要本发明公开了一种生物活性次级代谢产物（A'‑Neogammacer‑17(21)‑en‑15α‑ol）的制备方法和应用，所述真菌为Raffaelealauricola，提取方法包括：菌体活化及培养，乙酸乙酯萃取得粗提物，将粗提物进行多次硅胶柱层析纯化浓缩制得。本发明制备的A'‑Neogammacer‑17‑en‑15α‑ol对人乳腺癌细胞MCF‑7、肝癌细胞HePG2、肺癌细胞A549均有明显的抑制增殖效果，具有开发抗肿瘤药物的潜力。CN115323027ACN115323027A权利要求书1/1页1.一种生物活性次级代谢产物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）将Raffaelealauricola活化后，取菌块接种到PDB培养基中，在160～180r/min、20~28℃条件下连续培养5~10天，按15wt%~20wt%接种量转接到大米培养基中，继续在20～28℃条件下静置培养28～40天，得到菌丝体；2）将步骤1）得到的菌丝体在35~40℃下干燥后研磨成粉状，用1~2倍体积乙酸乙酯浸泡12~24小时，超声40~60分钟，收集萃取液，残渣中再加入菌丝体1~2倍体积的乙酸乙酯，超声40~60分钟，收集萃取液，重复以上步骤，共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏；3）将粗提物浸膏用氯仿或二氯甲烷溶解，然后用反相硅胶C18进行拌样，干法装柱，以甲醇：水自体积比1:9‑9:1梯度洗脱，收集甲醇：水体积比为9:1部位洗脱液，旋蒸浓缩得组分A；4）用1倍体积的氯仿溶解组分A，过200‑300目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比为30:1开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比为10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得浸膏，再过200‑300目硅胶柱，以石油醚：氯仿体积比为8:1开始梯度洗脱，收集石油醚:氯仿体积比为4:1部分洗脱液，再过200‑300目硅胶柱层析，以石油醚：乙酸乙酯体积比为20:1开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比为8:1部分洗脱液，旋蒸得到白色粉末状A'‑Neogammacer‑17‑en‑15α‑ol，即藿烷型三萜类化合物。2.根据权利要求1所述的生物活性次级代谢产物的制备方法，其特征在于：步骤1）中大米培养基：大米100g，木屑10g，加入纯水120mL，121℃高压灭菌20min。3.根据权利要求1所述的生物活性次级代谢产物的制备方法，其特征在于：步骤1）中菌块的大小为0.5×0.5cm，接种量为4块。4.根据权利要求1所述的生物活性次级代谢产物的制备方法，其特征在于：步骤2）中超声的功率为400W，频率为35KHz。5.根据权利要求1所述的生物活性次级代谢产物的制备方法，其特征在于：步骤3）中使用的反相硅胶C18粒径40‑60μm，孔径120Å。6.根据权利要求1所述的生物活性次级代谢产物的制备方法，其特征在于：步骤4）中梯度洗脱中石油醚：乙酸乙酯体积比依次为30:1,20:1,10:1,8:1；石油醚：氯仿体积比依次为8:1,6:1,4:1。7.一种如权利要求1‑6任一项所述的制备方法制得的生物活性次级代谢产物在抑制人乳腺癌细胞MCF‑7、肝癌细胞HePG2、肺癌细胞A549增殖的药物中的应用。2CN115323027A说明书1/4页一种生物活性次级代谢产物的制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于从微生物分离活性物质的技术领域，具体涉及Raffaelealauricola中生物活性次级代谢产物（A'‑Neogammacer‑17‑en‑15α‑ol）制备及应用。背景技术[0002]A'‑Neogammacer‑17(21)‑en‑15α‑ol是一种由五元环构成的藿烷型三萜类物质，是一种微生物代谢中常见的萜类化合物，自1986年荷兰学者vanEijk等在虫生真菌中分离得到两个三萜物质开始（VanEijkGW,RoeijmansHJ,SeykensD.Hopanoinsfromtheentomogenousfungusascherson