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(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115474564A(43)申请公布日2022.12.16(21)申请号202211118138.2C07K1/14(2006.01)(22)申请日2022.09.07(71)申请人华南农业大学地址510642广东省广州市天河区五山路483号(72)发明人李言伟但学明李雄曾诗敏赖学礼(51)Int.Cl.A01K61/10(2017.01)A61K39/002(2006.01)A61K39/39(2006.01)A61P33/02(2006.01)A61P33/14(2006.01)C12N15/12(2006.01)C12N15/70(2006.01)C07K14/44(2006.01)权利要求书3页说明书8页附图1页(54)发明名称一种斜带石斑鱼的养殖方法(57)摘要本发明旨在解决斜带石斑鱼养殖过程中感染刺激隐核虫后死亡率高的问题,在石斑鱼养殖过程中,为其注射一种免疫保护效果较好的重组蛋白疫苗,大大提高了斜带石斑鱼的抗病成活率。本发明也旨在解决刺激隐核虫疫苗制备成本较高且免疫保护效果不佳的技术问题,提供了一种基于刺激隐核虫膜蛋白CiIA1的亚单位疫苗制备方法,首次筛选鉴定出刺激隐核虫的CiIA1膜蛋白,并对其进行优化重组表达,以其作为抗原制备疫苗,大大提高了石斑鱼的抗刺激隐核虫感染的能力。CN115474564ACN115474564A权利要求书1/3页1.一种斜带石斑鱼的养殖方法,其特征在于:将斜带石斑鱼鱼苗投入养殖池,待7月鱼苗长至10‑15cm时,留出50‑100条放入新的养殖池中作为对照组,剩余的全部鱼苗作为免疫组,向免疫组鱼苗腹腔注射CiIA1亚单位疫苗一0.1ml/尾鱼,同时向对照组鱼苗腹腔注射PBS0.1ml/尾鱼;两周后再向免疫组鱼苗腹腔注射CiIA1亚单位疫苗二0.1ml/尾鱼,同时向对照组鱼苗腹腔注射PBS0.1ml/尾鱼;首次免疫注射四周后,用4000幼虫/尾鱼的刺激隐核虫幼虫对免疫组和对照组的部分石斑鱼进行攻毒;攻毒后第二天,将攻毒的鱼转移到特制包囊收集装置中,收集每尾鱼体脱落的刺激隐核虫包囊并计数,计算免疫组的减虫率;相较于PBS对照组,免疫组减虫率达到25%‑50%;上述CiIA1亚单位疫苗一的制备方法为:将1.0mg/ml的重组CiIA1蛋白溶液与弗氏完全佐剂按1∶1混合,匀浆机乳化;上述CiIA1亚单位疫苗二的制备方法为:将1.0mg/ml的重组CiIA1蛋白溶液与弗氏不完全佐剂按1∶1混合,匀浆机乳化;两种疫苗中的所述重组CiIA1蛋白溶液的制备方法如下:一、表达载体的构建刺激隐核虫膜蛋白CiIA1基因序列,共编码320个氨基酸,其中前19个氨基酸为信号肽区域,最后65个氨基酸为跨膜结构域;根据亲疏水性质分析,删除了疏水部分,选取了其中232个氨基酸作为目的蛋白,序列为:KTTAADWKGTFVVTSSSCLATCGWKIGTTVVIADKTGDATKVTWQGTVHTTDTTNVDVATGSCKYVSIVATEGQVGTATEVLNNDDTCEFGNGACTVMGKKQKTPGVVAFKRDMDLDTKPFQILYKQVEMVKKTSTTQKAAATDQANDCDTQASLVDTTTDAKAIVGTLKLSKATCDKCSWDTSKDLKITQDATKKYMVTLAGTIKETTAGDCANKLTASETCYVTKKDDKT:刺激隐核虫密码子的偏好性以及编码氨基酸类型与大肠杆菌存在巨大差异,为实现其在大肠杆菌中的良好表达,根据大肠杆菌密码子的特点,将编码上述蛋白序列的核酸序列逐个进行重新编码,重新设计后的核酸编码序列为:AAAACCACCGCAGCAGATTGGAAAGGGACGTTTGTGGTGACCTCAAGTAGCTGTTTAGCAACCTGTGGCTGGAAAATTGGCACCACCGTGGTTATTGCAGATAAAACCGGCGATGCAACCAAAGTGACCTGGCAGGGCACCGTTCATACCACCGATACCACCAATGTTGATGTTGCAACCGGCTCTTGTAAATATGTGAGTATTGTTGCAACCGAAGGTCAGGTGGGCACCGCAACCGAAGTGCTGAATAATGATGATACCTGTGAATTTGGTAATGGCGCATGTACCGTTATGGGCAAAAAACAGAAAACACCAGGCGTGGTTGCCTTTAAACGCGATATGGATCTGGATACCAAACCGTTTCAGATTCTGTATAAACAGGTTGAAATGGTTAAAAAAACCTCTACCACCCAGAAAGCAGCCGCAACCGATCAGGCCAATGATTGTGATACCCAGGCCTC