辣椒小果类病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测荧光探针、试剂盒及应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115820940A(43)申请公布日2023.03.21(21)申请号202211707226.6C12R1/94(2006.01)(22)申请日2022.12.29(71)申请人武汉海关技术中心地址430051湖北省武汉市汉阳区琴台大道588号申请人华中农业大学武汉理工大学(72)发明人曾宪东王振华徐文兴张建坤李乔王琴徐雪孙俊熊永红(74)专利代理机构武汉华旭知识产权事务所42214专利代理师高剑锋(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12N15/11(2006.01)C12Q1/686(2018.01)权利要求书1页说明书5页序列表（电子公布）附图2页(54)发明名称辣椒小果类病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测荧光探针、试剂盒及应用(57)摘要本发明属于病毒分子检测技术领域，具体涉及一种辣椒小果类病毒TaqMan实时荧光定量RT‑PCR检测荧光探针、试剂盒及应用。本技术方案所涉及的引物的核苷酸序列为：正向引物：5'‑GGGTTTTCACCCTTCCTTTC‑3'，反向引物：5'‑TGTTTCWRCDGGGATTACTCCTG‑3'；荧光探针的序列为：5'‑FAM‑CTCCCCCGAAGCCCGCTTAGGGAAAAAG‑BHQ1‑3'；试剂盒至少包括上述的引物和荧光探针。本发明提供的辣椒小果类病毒荧光定量PCR检测方法操作方便且快速，可对辣椒小果类病毒进行定量检测，该引物的特异性好，灵敏度高，适合于在植物病害诊断领域广泛推广应用。CN115820940ACN115820940A权利要求书1/1页1.一种辣椒小果类病毒TaqMan实时荧光定量RT‑PCR检测荧光探针，其特征在于序列为：5'‑FAM‑CTCCCCCGAAGCCCGCTTAGGGAAAAAG‑BHQ1‑3'。2.根据权利要求1所述的一种辣椒小果类病毒TaqMan实时荧光定量RT‑PCR检测荧光探针，其特征在于，与所述荧光探针配合使用的引物的核苷酸序列为：正向引物：5'‑GGGTTTTCACCCTTCCTTTC‑3'；反向引物：5'‑TGTTTCWRCDGGGATTACTCCTG‑3'。3.一种辣椒小果类病毒TaqMan实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒，其特征在于：至少包括权利要求1所述的荧光探针和权利要求2所述的引物。4.根据权利要求1～3中任一项所述辣椒小果类病毒TaqMan实时荧光定量RT‑PCR检测荧光探针、引物或试剂盒在检测辣椒小果类病毒中的应用。5.根据权利要求4所述的应用为从马铃薯纺锤块茎类病毒、金鱼草潜隐类病毒、辣椒小果类病毒、番茄顶缩类病毒、番茄褪绿矮缩类病毒和番茄雄性株类病毒这6种马铃薯纺锤形块茎类病毒属中鉴别出辣椒小果类病毒。6.根据权利要求3所述的一种辣椒小果类病毒TaqMan实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒，其特征在于：还包括TaqMan实时荧光PCR扩增预混液和阳性质粒。7.根据权利要求6所述的一种辣椒小果类病毒TaqMan实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒，其特征在于：阳性质粒是将SEQIDNO.1所示序列插入pGEM‑T载体中获得。8.根据权利要求7所述的一种辣椒小果类病毒TaqMan实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒，其特征在于用该试剂盒检测辣椒小果类病毒的方法为：步骤1.提取待测样品的RNA并逆转录为cDNA；步骤2.实时荧光PCR体系为：TaqMan实时荧光PCR扩增预混液12.5μL，上下游引物(10μmol/mL)各1.0μL，TaqMan探针(10μmol/mL)0.5μL，cDNA模板3.0μL，用ddH2O补充至总体积为25μL；实时荧光PCR反应条件为：50℃2min、95℃10min、95℃15s、60℃1min，40个循环；步骤3.检测结果判定：Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，则结果为阳性；无Ct值或无扩增曲线，结果为阴性；Ct值>35时，重做该样本，若重做结果无Ct值为阴性，否则为阳性。2CN115820940A说明书1/5页辣椒小果类病毒TaqMan实时荧光定量RT‑PCR检测荧光探针、试剂盒及应用技术领域[0001]本发明属于病毒分子检测技术领域，具体涉及一种辣椒小果类病毒TaqMan实时荧光定量RT‑PCR检测荧光探针、试剂盒及应用。背景技术[0002]茄科植物包括番茄(LycopersiconesclulantumMill)、马铃薯(SolanumtuberosumL.)、辣椒(CapsicumannuumL.)、烟草(NicotianatabacumL.)等重要蔬菜、经济和大田作物，在世界范围内广泛栽培，具有重要的经济价值。特别是马铃薯和番茄，分别是世界第一和第二大具有经济要性的蔬菜，在全世界17