一种高效无毒梨种质资源离体培养的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115843689A(43)申请公布日2023.03.28(21)申请号202211583526.8(22)申请日2022.12.09(71)申请人湖北省农业科学院果树茶叶研究所地址430064湖北省武汉市洪山区南湖大道10号(72)发明人范净胡红菊陈启亮杨晓平张靖国杜威董秀娟(74)专利代理机构北京东方盛凡知识产权代理有限公司11562专利代理师王宁宁(51)Int.Cl.A01H4/00(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图1页(54)发明名称一种高效无毒梨种质资源离体培养的方法(57)摘要本发明公开了一种高效无毒梨种质资源离体培养的方法，属于植物离体培养领域。所述方法包括以下步骤：取冬季休眠后至萌芽前的一年生梨树枝条离体培养，以抽出的5‑10cm嫩枝为外植体，用75％乙醇浸泡消毒两次后，接种MS固体培养基光照培养，获取梨种质资源离体组培苗。本发明采用休眠梨枝条室内培养出的嫩稍为外植体，仅用75％乙醇消毒两次，每次30s，离体培养可获得梨种质资源组培苗。该方法简单易行，操作简单，工序少，快速高效，无毒无残留，外植体不易褐变，污染率低，离体培养组培苗成活率最高可达100％，6‑9周可高效获得不同梨种质资源的离体组培苗。CN115843689ACN115843689A权利要求书1/1页1.一种高效无毒梨种质资源离体培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：以休眠后的一年生梨树枝条室内培养出的嫩稍为外植体，用75％乙醇浸泡消毒两次后，接种MS固体培养基光照培养，获取梨种质资源离体组培苗。2.如权利要求1所述的高效无毒梨种质资源离体培养的方法，其特征在于，所述梨树枝条室内培养出的嫩稍的方法为：将所述梨树枝条用1/10MS培养液培养，每5天更换一次所述1/10MS培养液，诱导培养出嫩稍；培养条件为：每天光照12h、光照强度为1500‑2100lx、温度为25‑27℃。3.如权利要求2所述的高效无毒梨种质资源离体培养的方法，其特征在于，所述嫩稍长至5‑10cm，展开叶片3‑5片，长出可见的节间2‑4个时，去除所述嫩稍上的叶片后作为外植体。4.如权利要求1所述的高效无毒梨种质资源离体培养的方法，其特征在于，消毒方法为：用75％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗3‑5次，再用75％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗3‑5次。5.如权利要求1所述的高效无毒梨种质资源离体培养的方法，其特征在于，所述MS固体培养基包括以下浓度组分：MS培养基+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂。6.如权利要求1所述的高效无毒梨种质资源离体培养的方法，其特征在于，光照培养条件为：温度为25‑27℃，光照强度为2000lx和光照时间为16h/d。2CN115843689A说明书1/6页一种高效无毒梨种质资源离体培养的方法技术领域[0001]本发明涉及植物离体培养领域，特别是涉及一种高效无毒梨种质资源离体培养的方法。背景技术[0002]梨是蔷薇科苹果亚科或梨亚科梨属(PyrusL.)多年生落叶果树，原产中国，因其适应性强，分布广，在全球80多个国家和地区都有种植，是世界性重要水果之一。梨的原种起源于第三纪的中国西部或西南山区，已知的梨属植物种有30个以上，其中我国原产的梨属植物有13个种，品种资源在3000份以上。[0003]农业种质资源是保障国家粮食安全和重要农副产品有效供给的战略性资源，是农业科技原始创新与现代种业发展的物质基础。种质资源安全保存与品种创新和种业发展直接相关，目前我国果树种质资源保存以田间圃保存为主，而西方发达国家相继建成了由种质圃、超低温库、试管苗库、低温种子库、DNA库等组成的多元化完整保存体系。中国果树种质资源多元化保存水平亟待提高，果树种质资源的离体培养是试管苗库能否建立的关键环节。[0004]目前通过离体培养可以获得不同梨品种的组培试管苗，比如‘莱阳茌梨’、‘锦丰’、‘早酥’、‘鸭梨’、‘秋白梨’、‘幸水’、‘新梨七号’、‘砀山酥梨’、‘黄花梨’等品种都获得了离体试管苗，不同品种离体培养方法有不同，没有统一且高效的培养方法。梨的离体培养大多选用田间健壮植株上春季或秋季的萌发无病虫害幼嫩新梢为外植体。幼嫩新梢去除叶片清水清洗后再消毒处理，消毒一般采用70％～75％乙醇浸泡10～30s，无菌水冲洗3～5次，再用0.1％HgCl2(升汞)消毒8～10min，最后用无菌水冲洗3～5次；或者2％～5％次氯酸钠浸泡8～15min，无菌水冲洗5～6次，再用0.1％HgCl2消毒8～10min，无菌水冲洗3～5次。离体培养中外植体消毒大多使用升汞或次氯酸钠为主要消毒剂，升汞的杀菌效果极好，但是有剧毒且不易将残留的药剂除净，会给环境造成污染，消毒后离体培养的死亡率极高；使用次氯酸钙毒性较小但杀菌效果一般，