检测黄单胞菌的引物、探针、试剂盒及快速检测草莓感染黄单胞菌的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115927685A(43)申请公布日2023.04.07(21)申请号202211425558.5(22)申请日2022.11.15(71)申请人中国农业科学院郑州果树研究所地址450009河南省郑州市管城回族区未来路南端郑州果树研究所(72)发明人李刚史春佳赵霞刘丽锋宋艳红周厚成(74)专利代理机构郑州大通专利商标代理有限公司41111专利代理师蔡少华(51)Int.Cl.C12Q1/689(2018.01)C12Q1/6844(2018.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/01(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表（电子公布）附图2页(54)发明名称检测黄单胞菌的引物、探针、试剂盒及快速检测草莓感染黄单胞菌的方法(57)摘要本发明属于病菌检测技术领域，公开了一种检测草莓黄单胞菌的引物，所述引物对的正向引物序列为：所述引物对的正向引物序列为：5′‑GTATGTGAATTTCCGGTCATTCTGCCCACT‑3′；反向引物序列为：5′‑CACTTGCCGACAACACCTTTGCCATAGAG‑3′。本发明引物特异性较好，不与其他真菌、细菌发生交叉反应。该引物组成的试剂盒可以在30min内完成草莓黄单胞菌的现场检测，检测时间短，检测成本低，且不需要专业人员就能操作，可在基层进行大规模推广。CN115927685ACN115927685A权利要求书1/1页1.检测草莓黄单胞菌的RPA引物对，其特征在于，所述引物对的正向引物序列为：5′‑GTATGTGAATTTCCGGTCATTCTGCCCACT‑3′；反向引物序列为：5′‑CACTTGCCGACAACACCTTTGCCATAGAG‑3′。2.检测草莓黄单胞菌的RPA探针，其特征在于，所述探针序列：5′‑GATTCTGAGCAATGCGTTGCTGACAGGCCGTAAAAGATTTGATGGT‑3′。3.检测草莓黄单胞菌的RPA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的RPA引物对、权利要求2所述的RPA探针、以冻干粉形式存在的RPA反应组分和RPA反应缓冲液。4.利用权利要求3所述的试剂盒快速检测草莓感染黄单胞菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：用核酸释放剂处理待测样品5min作为RPA反应核酸模板，利用试剂盒、模板配制RPA反应体系，在37℃‑39℃恒温扩增8‑10min，取10μL扩增产物用ddH2O稀释到200μL，取50μL滴入胶体金试纸条的点样孔中进行检测，2min后观察试纸条结果，若出现C线和T线两个红色条带或者一条T线红色条带表明待测样品为阳性，若出现一条C线红色条带则表明待测样品为阴性。2CN115927685A说明书1/6页检测黄单胞菌的引物、探针、试剂盒及快速检测草莓感染黄单胞菌的方法技术领域[0001]本发明属于病菌检测技术领域，涉及一种检测草莓黄单胞菌的引物、探针、试剂盒及快速检测草莓感染黄单胞菌的方法。背景技术[0002]草莓(Fragaria×ananassa)是一种重要的经济水果。随着草莓种植的迅速发展和栽培模式的多样化，草莓病害的种类和发生率不断增加严重影响草莓品质并导致经济损失。在草莓上常见的病原菌分为真菌、细菌、病毒三大类，其中细菌中的黄单胞菌对草莓产业具有严重破坏性。[0003]草莓黄单胞菌是一种生长缓慢的革兰氏阴性细菌，但草莓黄单胞菌的致病力很强，可以在草莓上低密度存活，易导致叶片角斑、茎腐，但在染病植株在初期不表现任何症状，随时间推移受感染的植株在叶表面上形成小的水浸病变，扩大并变成红色甚至坏死的病斑，严重时短缩茎部位感染出现空洞导致植物活力下降、倒伏和整个植物死亡，从而造成草莓产量大幅损失，引起巨大的经济损失。因该病原菌的特殊性，如果不在病害发生的初期采取合理防治措施，会导致草莓发病后损失巨大。所以有必要对草莓黄单胞菌进行早期快速、准确、灵敏地检测避免移栽后大面积的发生病害。[0004]近年来早期检测技术发展迅速，已从传统的目视检查、抗体检测发展到目前的分子检测，主要是聚合酶链反应(PCR)，该方法具有很高的特异性与灵敏度，也是目前针对草莓主要病害检测的最主要、应用最广泛的技术。为进一步提高检测效率和灵敏度在常规PCR的基础上发展了实时荧光PCR、巢式PCR等，但这些技术均具有一定的缺陷，需要配置昂贵设备以及较高专业技术的人员进行操作，并且方法步骤复杂导致消耗时间长，限制了其在病原菌快速检测中的应用。因此，研发更快速、易操作、可视化的现场检测的方法对于草莓病害的预防至关重要。发明内容[0005]本发明的目的在于提供检测草莓黄单胞菌的RPA引物对、探针及试剂盒，可以在30min内完成样品的现场检测，检测时间短，检测成本低，且不需要专