一种高效的芥菜型油菜遗传转化方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115976044A(43)申请公布日2023.04.18(21)申请号202211221551.1(22)申请日2022.10.08(71)申请人湖南省作物研究所地址410000湖南省长沙市芙蓉区马坡岭农科院内(72)发明人严明理黄伟李宝杨倩李莓曲亮王同华(74)专利代理机构长沙伊柏专利代理事务所(普通合伙)43265专利代理师丁敏(51)Int.Cl.C12N15/29(2006.01)C12N15/82(2006.01)A01H5/10(2018.01)A01H6/20(2018.01)权利要求书2页说明书6页序列表（电子公布）附图1页(54)发明名称一种高效的芥菜型油菜遗传转化方法(57)摘要本发明提供了一种高效的芥菜型油菜遗传转化方法，具体包括选择丙烯基硫甙含量20～40μmol/g的芥菜型油菜种子，并通过PCR筛选出同时含有WU和ST引物结合位点的种子；筛选的种子经过光照发芽，用含有基因编辑载体的农杆菌侵染无菌苗的下胚轴后再进行共培养及分化培养，每个阶段都使用特定的培养基进行培养、筛选和分化，得到小苗子后再置于添加有B5粉末的生根培养基中进行光照培养，得到再生苗；将再生苗培养直至生根，得到芥菜型油菜转化阳性植株。该遗传转化方法建立了芥菜型油菜的高效再生体系，大幅提高了芥菜型油菜再生苗的阳性率，可快速高效的获得基因编辑后的再生苗，为大规模创制芥菜型油菜突变体和在芥菜型油菜中鉴定基因的功能奠定基础。CN115976044ACN115976044A权利要求书1/2页1.一种高效的芥菜型油菜遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、受体材料的选择选择丙烯基硫甙含量20‑40μmol/g的芥菜型油菜种子，并从所选的芥菜型油菜种子通过PCR筛选出同时含有WU和ST引物结合位点的种子，即为受体材料；所述引物WU为F1/R1引物对，所述ST引物为F2/R2引物对，所述F1的基因序列如SEQIDNO.1所示：ATGGAGCAACCGCAACATC；所述R1的基因序列如SEQIDNO.2所示：CATGGTTGTGCCGTTGAATC；所述F2的基因序列如SEQIDNO.3所示：TTGACAAACCCATTCGTCCTC；所述R2的基因序列如SEQIDNO.4所示：AGCTTCAAGAGCGCGCTTT；S2、发芽将步骤S1中筛选的受体材料芥菜型油菜种子进行消毒灭菌，将消毒灭菌后的种子摆入H0培养基中培养发芽；所述H0培养基为：2.2g/LMS、7.5g/L琼脂粉，PH为6.5；S3、侵染及共培养将步骤S2中培养的芥菜型油菜幼苗中切取下胚轴，将下胚轴与含有CRISPR/Cas9载体的农杆菌在DM培养基共培养，得到侵染的外植体，然后将外植体转移至H1培养基中进行暗培养；所述DM培养基为：4.4g/LMS、32g/L蔗糖，使用前加入100mM乙酰丁香酮，PH为6.5；所述H1培养基为：4.4g/LMS、32g/L蔗糖、20g/L甘露醇、1.1mg/L2,4‑二氯苯氧乙酸、0.33mg/L6‑糖基氨基嘌呤、7.2g/L琼脂糖，使用前加入100mM乙酰丁香酮，PH为6.5；S4、筛选及分化将步骤S3中经暗培养后的外植体转移至H2培养基培养2～3周，然后再将外植体转入H3培养基中进行继代培养，直至长出再生苗；所述H2培养基为：4.4g/LMS、32g/L蔗糖、20g/L甘露醇、1mg/L2,4‑二氯苯氧乙酸、0.3mg/L6‑糖基氨基嘌呤、7.2g/L琼脂糖，H2培养基使用前加入25mg卡那霉素、STS100μL、卡西林钠和克拉维酸钾混合物300mg，PH为6.5；所述H3培养基为：4.4g/LMS、10g/L葡萄糖、0.25g/L木糖、0.6g/LMES、7g/L琼脂糖，H3培养基使用前加入25mg卡那霉素、100μLSTS、300mg卡西林钠和克拉维酸钾、1mg玉米素、3.3mg6‑苄氨基嘌呤，PH为6.5；S5、生根取步骤S3中长出的再生苗转移至H4培养基，培养直至生根，通过PCR检测筛选得到芥菜型油菜转化阳性植株；所述H4培养基为：3.5g/LB5粉末、18g/L蔗糖、8.5g/L琼脂粉，使用前加入100mg3‑吲哚乙酸、300mg卡西林钠和克拉维酸钾，PH为6.5。2.根据权利要求1所述的高效的芥菜型油菜遗传转化方法，其特征在于，所述步骤S2中消毒灭菌的方法为：先用75％的酒精浸泡芥菜型油菜种子1～10min，再用浓度为1.5％升汞2CN115976044A权利要求书2/2页浸泡种子15～20min，最后用灭菌的单蒸水冲洗种子3～5次。3.根据权利要求1所述的高效的芥菜型油菜遗传转化方法，其特征在于，所述步骤S2中培养条件为：于24℃温度下，先暗培养4天，后放入16h光