一种提高柞蚕微孢子虫发芽率的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115975810A(43)申请公布日2023.04.18(21)申请号202211541952.5(22)申请日2022.12.03(71)申请人沈阳农业大学地址110000辽宁省沈阳市沈河区东陵路120号(72)发明人王勇秦子怡郑圣纬刘微卜舒扬姜义仁杨瑞生秦利(74)专利代理机构沈阳一诺君科知识产权代理事务所(普通合伙)21266专利代理师刘丽娟(51)Int.Cl.C12N1/10(2006.01)C12R1/90(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图3页(54)发明名称一种提高柞蚕微孢子虫发芽率的方法(57)摘要本发明公开了一种提高柞蚕微孢子虫发芽率的方法，以3％H2O2为柞蚕微孢子虫发芽培养基，将柞蚕微孢子虫悬浮液与柞蚕微孢子虫发芽培养基以体积比为1:5混合，于18‑40℃的金属浴10‑60min。与现有技术相比，本发明以3％H2O2为柞蚕微孢子虫发芽培养基，可以使柞蚕微孢子虫的发芽率从传统(PH＝12的KOHPBS的溶液)30％左右提高到86％以上，显著提高柞蚕微孢子虫发芽率。CN115975810ACN115975810A权利要求书1/1页1.一种提高柞蚕微孢子虫发芽率的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、制备柞蚕微孢子虫悬浮液；S2、以3％H2O2为柞蚕微孢子虫发芽培养基，将柞蚕微孢子虫悬浮液与柞蚕微孢子虫发芽培养基以体积比为1:5混合，于18‑40℃的金属浴10‑60min。2.根据权利要求1所述的提高柞蚕微孢子虫发芽率的方法，其特征在于：所述柞蚕微孢子虫悬浮液的浓度为1×105个孢子/mL。3.根据权利要求1所述的提高柞蚕微孢子虫发芽率的方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括：将感染柞蚕微孢子虫的病蚕、病蛾或病蛹，置于研钵内研磨成匀浆，用4层纱布过滤，收集滤液至50mL离心管内；滤液离心分离后弃上清液，重复操作3‑4次后得到柞蚕微孢子虫粗提液；柞蚕微孢子虫粗提液采用Percoll不连续密度梯度离心法纯化，用血球计数板计数，浓度调节至1×105个孢子/mL，即得柞蚕微孢子虫悬浮液，于4℃下保存备用。4.根据权利要求1所述的提高柞蚕微孢子虫发芽率的方法，其特征在于：所述金属浴温度为35℃。5.根据权利要求1所述的提高柞蚕微孢子虫发芽率的方法，其特征在于：所述金属浴时间为30min。6.根据权利要求3所述的提高柞蚕微孢子虫发芽率的方法，其特征在于，所述滤液离心分离采用差速离心方法，具体为：以500r/min离心2min，取上清液，再以2500r/min离心10min，弃上清液。2CN115975810A说明书1/4页一种提高柞蚕微孢子虫发芽率的方法技术领域[0001]本发明涉及柞蚕微孢子虫孢子在体外情况下的侵染机制研究，孢子在一定的环境中弹出极管寄生宿主，特别是一种环境条件优化提高柞蚕微孢子虫发芽率的方法。背景技术[0002]微孢子虫(Microsporidia)作为一种专性细胞内寄生的原生动物，能广泛寄生于动物躯体，引起许多昆虫、水产动物甚至灵长类动物等的严重病害。昆虫微孢子虫既是害虫生物防治的一种素材，又是特种经济昆虫的重要胚胎传染性病原，微孢子虫侵染寄主是以其孢子的发芽为基础的，孢子是微孢子虫生命周期从休眠到增殖的关键阶段。探明微孢子虫孢子发芽机理，对于研究微孢子虫侵染寄主的机理，深入了解孢子入侵和繁殖过程，以及体外研究微孢子虫病具有重要意义。[0003]微孢子虫的生活史可分为侵染期(孢子发芽)、繁殖期(裂殖生殖)和孢子形成期等3个阶段。与发芽有关的特征性孢子结构有：由蛋白质外壁、几丁质内壁和原生质膜3层结构构成的孢子壁，坚硬但有一定的选择透性；由4层膜包围成中心芯结构的极丝，沿孢子壁内侧螺旋状盘绕，孢子发芽时能外翻装配成极管：由若干迭成片状的薄膜组成、结构相对松散的极膜层和由多层膜包围而成的后极泡，两者在孢子发芽过程中能大量吸收水分而膨胀(IshiharaR，1985；WeiderE，1982)。极丝的弹出是微孢子虫孢子发芽的重要过程，孢子受刺激物质作用并活化后，主要通过极膜层大量吸收水分，达到一定膨压后将其压力转移到后极泡，随着后极泡膨大，极丝开始突出，逐渐解开螺旋并形成极管，同时吸入孢原质，从极帽处弹出，孢原质经极管排出并注入寄主组织(钱永华，金伟，1997)。微孢子虫发芽机制一直是研究的热点，有研究显示借助扫描电镜观察微孢子虫在培养细胞体系中可以以长极丝的形式完成发芽(李艳红等，2007)。[0004]虽然微孢子虫孢子在进化学上被认为是从真菌或真菌的类似物中分化而来(BrownJR,DoolittleWF.,1997)，但其发芽与真菌孢子的发芽有很大不同。第一种被报道的微孢子虫是家蚕微孢子虫(Nosemabombycis)，为