大花蕙兰与国兰杂交育种方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109452161A(43)申请公布日2019.03.12(21)申请号201811324745.8(22)申请日2018.11.08(71)申请人云南农业大学地址650000云南省昆明市盘龙区北郊黑龙潭(72)发明人王玉英李枝林杨小丹李茹凌青(74)专利代理机构昆明祥和知识产权代理有限公司53114代理人和琳(51)Int.Cl.A01H1/02(2006.01)A01H1/04(2006.01)权利要求书3页说明书7页附图1页(54)发明名称大花蕙兰与国兰杂交育种方法(57)摘要本发明具体涉及植物遗传育种技术领域，具体为一种高效的大花蕙兰与国兰杂交育种方法，通过CTAB法提取植物基因组DNA，采用SCAR标记引物进行PCR扩增，构建系统进化树；采用PartecCyFlowSpace鉴定大花蕙兰植株倍性；根据亲缘关系和倍性亲本选配；用TTC染色法对测定国兰的花粉活力，用联苯胺—过氧化氢溶液进行大花蕙兰柱头可授性测定。结合大花蕙兰的植株倍性，选择其中的二倍体大花蕙兰品种作为母本，同时选择与二倍体大花蕙兰品种亲缘关系较近的国兰品种作为父本：杂交手段为正交杂交法。该方法降低了大花蕙兰与国兰亲本选配的盲目性，提高了育种效率。CN109452161ACN109452161A权利要求书1/3页1.大花蕙兰与国兰杂交育种方法，其特征在于该方法包括下列步骤：亲本选配：根据中华人民共和国农业行业标准《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南（兰属）》对植株的形态进行描述；通过植物基因组DNA的CTAB法提取植物基因组DNA，采用SCAR标记引物进行PCR扩增，构建系统进化树；通过植物基因组DNA的CTAB法提取植物基因组DNA，采用SCAR标记引物进行PCR扩增，构建系统进化树；采用PartecCyFlowSpace鉴定大花蕙兰植株倍性；根据亲缘关系和倍性亲本选配；用TTC染色法对测定国兰的花粉活力，用联苯胺—过氧化氢溶液进行大花蕙兰柱头可授性测定；以SCAR分子标记的亲缘关系的数系结构图为基础，结合大花蕙兰的植株倍性，选择其中的二倍体大花蕙兰品种作为母本，同时选择与二倍体大花蕙兰品种亲缘关系较近的国兰品种作为父本：杂交手段为正交杂交法；当花朵开放20-25d开始授粉，取其花葶中上部开放3～7d的1～3朵进行杂交；授粉选择在晴天进行，授粉前先把国兰花粉块顶端的药帽去掉，再把大花蕙兰花粉块用干净的镊子轻轻取下来，之后将国兰的花粉块放入大花蕙兰的蕊腔中。2.如权利要求1所述的大花蕙兰与国兰杂交育种方法，其特征在于SCAR标记引物进行PCR扩增的具体操作包括：取新鲜植物组织100g，加入液氮充分研磨；加入250μLRBI，15μLRNaseA充分混匀；55℃水浴孵育15min；12000rpm离心5min，轻轻吸取上清于干净的离心管中；加入100μL溶液PBI中，充分混匀，冰浴5min，12000rpm离心5min；轻轻吸取上清于干净的离心管中，加入375μL溶液BBI；(使用前加无水乙醇)，充分混匀；吸全部的混合液加入离心柱中，12000rpm离心30s，弃去流出液；加入500μL溶液CBI，12000rpm离心30s，弃去流出液；加入500μL溶液WBI，12000rpm离心30s，弃去流出液（使用前加无水乙醇）；重复步骤9一次；12000rpm离心2min，彻底去除残留的WBI；将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入100μL预热EB（60-70℃），室温静置1min，12000rpm离心1min，洗脱DNA；取5μL的DNA样品与2μL的10×Lodingbuffer混匀后上样，用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳缓冲液为1×TAE缓冲液，电泳条件为：120V，电泳25min；电泳结束后将凝胶放入IQuantcapture凝胶成像系统中，进行拍照观察，根据所用Marker估测样品DNA的浓度和分子量；以提取的所有兰花资源的DNA为模板进行PCR的扩增，扩增的引物为之前实验室的研究结果，实验参数如下：引物序列：2CN109452161A权利要求书2/3页取5μL的PCR产物与2μL的10×Lodingbuffer混匀后上样，用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳缓冲液为1×TAE缓冲液，电泳条件为：120V，电泳25min；电泳结束后将凝胶放入IQuantcapture凝胶成像系统中，进行拍照观察，根据所用Marker估测样品目的条带的浓度和分子量；PCR产物经电泳检测后，产物进行测序；序列用软件BioEdit的CLUSTALW程序进行对位排列后，再进行手工校正；在软件MEGA4.0中，采用Kimura2-parameter方法，计算出国兰品种的遗传距离；用MEGA