一种多耐性高产酒精酵母突变株TT31及其筛选方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102154138A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102154138A(43)申请公布日2011.08.17(21)申请号201110025114.8C12R1/865(2006.01)(22)申请日2011.01.24(83)生物保藏信息CGMCCNo.45182010.12.29(71)申请人天津科技大学地址300457天津市塘沽区经济技术开发区十三大街29号(72)发明人王昌禄潘静李风娟王玉荣陈勉华(74)专利代理机构天津盛理知识产权代理有限公司12209代理人王来佳(51)Int.Cl.C12N1/18(2006.01)C12N13/00(2006.01)C12N15/04(2006.01)权利要求书2页说明书7页附图1页(54)发明名称一种多耐性高产酒精酵母突变株TT31及其筛选方法(57)摘要本发明涉及一种多耐性高产酒精酵母突变株TT31及其筛选方法，利用基因组改组技术筛选耐高温、耐酒精、耐酸的高产酒精酵母诱变株的方法，步骤如下：对三株酵母菌株进行紫外线诱变，采用TTC法一级筛选、杜氏管发酵法二级筛选、摇瓶发酵法三级筛选，选出具有三种耐性且酒精产量明显提高的10株酵母突变株，对其进行原生质体制备，经过三轮的基因组改组，最终得到了对温度、酒精和酸耐性都有较大提高的酵母突变菌株TT31，该突变株在35℃条件下，以蔗糖为碳源进行酒精发酵72h，酒精产量达到了101.9g/L。CN1025438ACCNN110215413802154139A权利要求书1/2页1.一种多耐性高产酒精酵母突变株TT31，其特征在于：保藏编号为：CGMCCNo.4518，保藏日期：2010年12月29日，保藏地址为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为酿酒酵母Saccharomycescrevisiae。2.根据权利要求1所述的多耐性高产酒精酵母突变株TT31，其特征在于：所述突变株TT31最适发酵温度为35℃，最适发酵pH4.5，耐高温49℃，耐酒精20％，耐酸为pH2.6。3.根据权利要求1所述的一种多耐性高产酒精酵母突变株TT31的筛选方法，其特征在于：步骤如下：(1)出发菌株的紫外线诱变：培养三株酵母菌株，取10mL培养至对数期的菌悬液，加至带磁力棒、直径90mm的培养皿中，置于磁力搅拌器载物台上，距离为20cm，开启紫外灯，预热20min，开启搅拌器，打开皿盖，在紫外灯照射下搅拌并计时，分别于0s、15s、30s、45s、60s、75s、90s各取1mL菌液，进行10倍系列稀释后，取0.1mL涂布于平板上，30℃培养2～3d后计数、观察结果，选取80％致死率的诱变剂量再进行诱变；(2)诱变株的筛选：酵母菌经紫外线诱变后，取0.1mL分别涂布于含乙醇分别为9％，10％，11％，12％，13％，14％平板上，分别放入30℃、35℃培养箱中，培养2～3d，挑取生长较快的菌株进行杜氏管耐酒精、耐酸及酒精发酵试验，从中选出耐酒精，耐酸及酒精产量较高的突变株t1、t2、t3、t4、t5、t6、t7、t8、t9、t10用于基因组改组；(3)诱变菌株的原生质体制备：将t1、t2、t3、t4、t5、t6、t7、t8、t9、t10菌株分别接种于50mLYEPD液体培养基中，30℃，120r/min摇床培养12～16h，收集对数生长期细胞，各取5mL加入离心管中，3500r/min离心5min，用生理盐水洗涤两次，加入0.2％β-巯基乙醇溶液，30℃，120r/min振荡处理10min，用KCl高渗缓冲液洗涤三次，离心弃去上清液，加入2％的蜗牛酶液5mL，渗透压稳定剂为0.5mol/L蔗糖，30℃，120r/min振荡下酶解1.5h，每隔0.5h取样进行镜检观察，待视野中90％以上为原生质体时，2000r/min离心10min，用KCl高渗缓冲液洗涤两次，离心收集原生质体；(4)第一轮基因组改组：各取0.5mLt1、t2、t3、t4、t5、t6、t7、t8、t9、t10菌株的原生质体，浓度为106个/mL，混合，30℃振荡处理15min，2000r/min离心10min，收集细胞，加入2mL35％PEG-4000促融剂，30℃，120r/min振荡处理20min，2000r/min离心10min，用KCl高渗缓冲液洗涤两次，取0.1mL菌液涂布于再生培养基平板上，其中YEPD琼脂培养基添加蔗糖至0.5mol/L，分别置于44℃、45℃、46℃和47℃恒温培养箱中培养2～3d，待长出菌落后覆盖一层TTC上层培养基，避光保温2～3h，比较各菌株间颜色深浅，实验重复3次，从中筛选出颜色较深的菌株，接种到内含杜氏管的酒精梯度试管中，酒精浓度分别为13％～17％