基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110885877A(43)申请公布日2020.03.17(21)申请号201911267063.2(22)申请日2019.12.11(71)申请人厦门大学地址361000福建省厦门市思明南路422号(72)发明人李博安杨朝勇张睿孙珍林康凤郭剑光洪欣欣(74)专利代理机构北京权智天下知识产权代理事务所(普通合伙)11638代理人王新爱(51)Int.Cl.C12Q1/6851(2018.01)权利要求书2页说明书7页附图4页(54)发明名称基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法(57)摘要本发明公开了本发明描述了基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法，所述方法包含以下试剂和步骤，包括：将待测样品的核酸、恒温扩增混合液以及基因编辑核酸检测液同时注入数字微流控芯片中相对应的位置；接着启动程序通过电流自动驱动液滴，使待检测样品的核酸液滴先与恒温扩增混合液的液滴混合并在芯片上反复流动混匀，在37-42℃，10-15分钟来进行核酸恒温扩增；随后将基因编辑核酸检测液的液滴通过电流自动驱动，并与上述混合液滴混匀，在37℃反应10-30分钟后用荧光探测装置，从而推断目的核酸的有无；该方法显示出恒温下高灵敏度和快速检测的巨大潜能，整个检测过程缩短在1小时之内，自动化程度高，不涉及开盖，杜绝气溶胶污染。CN110885877ACN110885877A权利要求书1/2页1.基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法，其特征在于：该检测方法包括以下步骤：步骤一、将待测样品的核酸、恒温扩增混合液以及基因编辑核酸检测液同时注入数字微流控芯片中相对应的位置；步骤二、启动程序，通过电流自动驱动液滴，使得待测样品的核酸的液滴与恒温扩增混合液混合并在芯片上反复流动混匀，在37-42℃下进行核酸恒温扩增10-15min；步骤三、将基因编辑核酸检测液的液滴通过电流驱动，并与步骤二中混合后的液体混匀，37℃条件下反应10-30min，用荧光探测装置探测数字微流控芯片上的混合液滴的荧光。2.根据权利要求1所述的基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法，其特征在于：所述待测样品的核酸为DNA或RNA。3.根据权利要求1-2任意一项所述的基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法，其特征在于：所述的恒温扩增混合液包括：重组酶，辅助蛋白，单链DNA结合蛋白，DNA聚合酶，正向引物，反向引物以及反应缓冲液，如果模板是RNA，所述的恒温扩增混合液还包括逆转录酶。4.根据权利要求3所述的基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法，其特征在于：所述重组酶为80-600ng/ul重组酶T4噬菌体uvsX蛋白或大肠杆菌RecA，所述辅助蛋白为20-380ng/ul辅助蛋白T4噬菌体uvsY蛋白，所述单链DNA结合蛋白为200-800ng/ul单链结合蛋白gp32，所述DNA聚合酶为10-300ng/ulDNA聚合酶，所述正向引物为0.2-0.6uM，所述反向引物为0.2-0.6uM，所述逆转录酶为10-600ng/ul。5.根据权利要求3所述的基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法，其特征在于：所述的反应缓冲液包括：5-20mMMgAc，20-200mMTris-HCl，1-10mMDTT，4-12％(w/v)聚乙二醇，20-100mM乙酸钾，1-20mMATP，0.1-4mMdNTPs，10-100mM磷酸肌酸，10-80ug/U肌酸激酶，缓冲液的PH值为7.5-8.5。6.根据权利要求1-2任意一项所述的基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法，其特征在于：所述的基因编辑核酸检测液包括：引导RNA(crRNA)，荧光探针，基因编辑酶Cas12a蛋白。7.根据权利要求6所述的基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法，其特征在于：所述引导RNA(crRNA)为100-800nM，所述荧光探针为10-400nM，基因编辑酶Cas12a蛋白为50-500ng/ul，基因编辑酶为Cas12a蛋白来自于毛螺菌科细菌：LachnospiraceaebacteriumND2006，经基因工程将Cas12a蛋白基因克隆到大肠杆菌中进行大量提纯。8.根据权利要求6所述的基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法，其特征在于：所述荧光探针，其碱基长度为5，序列为TTATT或TCCCT或TTCTT，一端含有荧光基团修饰：5-FAM或FITC，另一端含有淬灭基团修饰：BHQ1或TAMRA。9.根据权利要求1-2任意一项所述的基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法，其特征在于：所述数字微流控芯片由两部分组