一种杜仲转基因植株再生体系的构建方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113122569A(43)申请公布日2021.07.16(21)申请号202110454403.3(22)申请日2021.04.26(71)申请人北京林业大学地址100083北京市海淀区清华东路35号(72)发明人孟冬杨清杨琬珑付玉杰刘腾跃杜婷婷牛丽丽董碧莹曹红燕(74)专利代理机构北京高沃律师事务所11569代理人李博(51)Int.Cl.C12N15/82(2006.01)A01H4/00(2006.01)A01H5/00(2018.01)A01H6/00(2018.01)权利要求书1页说明书8页附图2页(54)发明名称一种杜仲转基因植株再生体系的构建方法(57)摘要本发明提供了一种杜仲转基因植株再生体系的构建方法，属于植物转基因技术领域。本发明提供的杜仲转基因植株再生体系的构建方法，包括如下步骤：将含目标基因重组载体的发根农杆菌悬浮液注射到杜仲幼苗的茎部，待杜仲幼苗茎部伤口处的愈伤组织分化为再生毛状根，以再生毛状根为外植体消毒，组织培养，直至获得完整的杜仲转基因幼苗。本发明利用分子调控机制建立的杜仲Hariyroot转基因植株再生体系，可将杜仲快速高效的培养成为转基因植株，实现了杜仲的高效转化，快速再生。而且本发明构建方法简单，解决了木本植物转基因困难，操作繁琐，转化率低的问题，培育出的组培苗苗龄相同，性状优良，生长状态保持一致且良好，分化率和生根率均较高。CN113122569ACN113122569A权利要求书1/1页1.一种杜仲转基因植株再生体系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：将含目标基因重组载体的发根农杆菌悬浮液注射到杜仲幼苗的茎部，待杜仲幼苗茎部伤口处的愈伤组织分化为再生毛状根，以再生毛状根为外植体进行组织培养，直至获得完整的杜仲转基因幼苗。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述发根农杆菌的菌株包括K599、MSU440、C58C1或ArA4。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述杜仲幼苗为生长10‑20天的幼苗。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述注射的位置位于幼苗原始毛状根系上方0.5‑1.5cm处的茎部。5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述发根农杆菌悬浮液的OD600值为0.3‑0.7。6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述组织培养的温度为23‑27℃，光照周期为16h，光照强度为1800Lx。7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述组织培养的愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+2‑2.5mg/L6‑BA+1‑1.5mg/LNAA+700‑800mg/L脯氨酸+500‑600mg/LLH+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8。8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述组织培养的愈伤组织分化培养基为：基础培养基+1.0‑1.5mg/L6‑BA+1.0‑1.5mg/LIAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8。9.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述组织培养的生根培养基为：基础培养基+30‑35g蔗糖，pH为5.8‑6。10.根据权利要求1‑9任意一项构建方法构建所得的杜仲转基因植株。2CN113122569A说明书1/8页一种杜仲转基因植株再生体系的构建方法技术领域[0001]本发明属于植物转基因技术领域，尤其涉及一种杜仲转基因植株再生体系的构建方法。背景技术[0002]杜仲(学名EucommiaulmoidesOliver)是我国独特的经济木本植物资源，具有重要的经济价值和科学价值。我国每年对于天然橡胶的需求量极高，每年消费的天然橡胶量位列世界首位。我国天然橡胶主要以海南的三叶橡胶为原材料，但由于三叶橡胶属热带植物，而我国热带地区国土面积较小，使得三叶橡胶在我国适生区域很窄，仅能在海南岛和西双版纳等地栽培，如今其产能已达极限，所以目前我国三叶橡胶资源十分匮乏。为了满足橡胶需求，我国严重依赖于进口橡胶。近年来发现，在杜仲植物的果实、树皮、叶和根中均含有丰富的天然橡胶。其结构为反式聚异戊二烯，具有热塑性、热弹性和橡胶弹性等优点，而我国很多地区的环境条件适合杜仲的生长，如今我国杜仲种植面积达到世界杜仲种植面积的99％以上，相对于其他国家，具有很强的栽培优势。因此杜仲胶可以作为海南三叶橡胶的优良替代资源，成为我国天然橡胶的战略资源。由于杜仲的较高经济价值，近年来大批量的培养也成为现在比较值得关注的问题，但杜仲属于木本植物，传统的种植对生长环境条件要求较高，生长周期长，现阶段杜仲胶的产量过低而生产成本相对过高，这在很大程度上制约了杜仲胶的应用和产业的发展。[0003]而现阶段我国杜仲的无性繁殖方式还以扦插，嫁接为主，这些方式时间