RNA指导的基因编辑和基因调节.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114230675A(43)申请公布日2022.03.25(21)申请号202111496852.0J.B.布拉克(22)申请日2014.06.05(74)专利代理机构中国专利代理(香港)有限公(30)优先权数据司7200161/8314812013.06.05US代理人初明明61/8391272013.06.25US(51)Int.Cl.61/9049112013.11.15USC07K19/00(2006.01)61/9674662014.03.19USA61K38/46(2006.01)61/9815752014.04.18USA61K48/00(2006.01)(62)分案原申请数据C12N15/85(2006.01)201480044748.X2014.06.05C12N15/90(2006.01)(71)申请人杜克大学地址美国北卡罗来纳州(72)发明人C.A.格斯巴奇I.B.希尔顿P.佩雷兹皮内拉A.M.卡巴迪P.I.塔科雷D.G.奥斯特劳特权利要求书2页说明书97页附图73页(54)发明名称RNA指导的基因编辑和基因调节(57)摘要本文公开了基于成簇有规间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)9的系统相关组合物和使用所述基于CRISPR/Cas9的系统相关组合物用于改变基因表达和基因组工程改造的方法。本文还公开了使用所述组合物用于在肌肉例如骨骼肌和心肌中改变基因表达和基因组工程改造的组合物和方法。CN114230675ACN114230675A权利要求书1/2页1.一种融合蛋白，其包含第一多肽结构域和第二多肽结构域，所述第一多肽结构域包含成簇有规间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白，所述第二多肽结构域具有选自以下的活性：转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、核酸酶活性、核酸缔合活性、甲基化酶活性和脱甲基酶活性。2.一种DNA打靶系统，其包含权利要求1的融合蛋白和至少一种指导RNA(gRNA)。3.权利要求2的DNA打靶系统，其中所述至少一种指导RNA靶向选自以下的基因的启动子区：ASCL1、BRN2、MYT1L、NANOG、VEGFA、TERT、IL1B、IL1R2、IL1RN、HBG1、HBG2和MYOD1；或者其中所述至少一种指导RNA包含SEQIDNO:5‑40、65‑144、492‑515、540‑563和585‑625的至少一个。4.一种结合肌养蛋白基因的DNA打靶系统，所述DNA打靶系统包含Cas9和至少一种指导RNA(gRNA)。5.一种结合γ珠蛋白基因的DNA打靶系统，所述DNA打靶系统包含Cas9和至少一种指导RNA(gRNA)。6.一种多核苷酸，其编码权利要求1的融合蛋白或权利要求2‑5中任一项的DNA打靶系统。7.一种载体，其包含权利要求6的多核苷酸。8.一种病毒载体，其包含编码成簇有规间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白的第一多核苷酸和编码至少一种指导RNA(gRNA)的第二多核苷酸。9.一种用于调节细胞中基因表达的组合物，所述组合物包含权利要求1的融合蛋白、权利要求2‑5中任一项的DNA打靶系统、权利要求6的多核苷酸或权利要求7或8的载体。10.一种用于诱导细胞中基因表达的组合物，所述组合物包含权利要求1的融合蛋白、权利要求2‑5中任一项的DNA打靶系统、权利要求6的多核苷酸或权利要求7或8的载体。11.一种用于在受试者中调节或编辑基因的组合物，所述组合物包含权利要求1的融合蛋白、权利要求2‑5中任一项的DNA打靶系统、权利要求6的多核苷酸或权利要求7或8的载体。12.一种用于在受试者的肌肉中调节或编辑基因的组合物，所述组合物包含腺伴随病毒(AAV)载体和编码位点特异性核酸酶的多核苷酸。13.一种细胞，其包含权利要求1的融合蛋白、权利要求2‑5中任一项的DNA打靶系统、权利要求6的多核苷酸、权利要求7或8的载体或权利要求9‑12中任一项的组合物。14.一种药盒，其包含权利要求1的融合蛋白、权利要求2‑5中任一项的DNA打靶系统、权利要求6的多核苷酸、权利要求7或8的载体、权利要求9‑12中任一项的组合物或权利要求13的细胞。15.一种调节细胞中至少一个内源基因的表达的方法，所述方法包括使细胞与权利要求1的融合蛋白、权利要求2‑5中任一项的DNA打靶系统、权利要求6的多核苷酸、权利要求7或8的载体或权利要求9‑12中任一项的组合物接触。16.一种激活细胞中的内源基因的方法，所述方法包括使细胞与权利要求1的融合蛋白、权利要求2‑5中任一项的DNA打靶系统、权利要求6的多核苷酸、权利要求7或8的载体或权利要求9‑12中任一项的组合物接触。17.一种使细胞转分化或诱导细胞分