应用蛋白质组学技术筛选猪产仔数相关候选基因的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102229977A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102229977A(43)申请公布日2011.11.02(21)申请号201110118976.5(22)申请日2011.05.10(71)申请人武汉大学地址430072湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学(72)发明人周荣家程汉华陈科(74)专利代理机构武汉科皓知识产权代理事务所(特殊普通合伙)42222代理人张火春(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)G01N33/68(2006.01)权利要求书1页说明书7页附图3页(54)发明名称应用蛋白质组学技术筛选猪产仔数相关候选基因的方法(57)摘要本发明涉及一种应用蛋白质组学技术筛选猪产仔数相关候选基因的方法。本发明公开了一种筛选与猪产仔数相关候选基因的方法，该方法利用中国特有的高产猪种梅山猪以及产仔数低的中国野猪，通过差显技术从它们卵巢中寻找差异蛋白，特别是在梅山猪卵巢中高表达的基因，以期快速而大规模的鉴定与产仔数相关联的基因。这种方法与以往的筛选候选基因具有快速，准确，并且可以与转基因动物技术相结合为我国转基因新品种培育和产业化提供原动力。CN10297ACCNN110222997702229978A权利要求书1/1页1.筛选与猪产仔数相关候选基因的方法，该方法是通过差显技术比较梅山猪与野猪（SusScrofa）卵巢之间蛋白表达的差异，并由此确定候选基因。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述差显技术为双向荧光差异凝胶电泳-质谱联用技术。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：1）利用2D-DIGE寻找差异蛋白a、分别将梅山猪卵巢组织和野猪卵巢组织用PBS清洗后，加入DIGE裂解液并匀浆，超声破碎细胞，离心取上清，得到蛋白样品；b、用不同荧光染料分子分别标记梅山猪卵巢蛋白样品和野猪卵巢蛋白样品，进行双向电泳，用荧光扫描仪获得2D-DIGE图像，并基于此获得差异蛋白质点；2）差异蛋白点的质谱鉴定将步骤1）a得到的蛋白样品分别进行双向电泳，考马斯亮蓝染色，并切下差异蛋白质点，进行质谱分析。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：1）利用2D-DIGE寻找差异蛋白a、分别将梅山猪卵巢组织和野猪卵巢组织300mg在冰上剪切成3mm见方的小块，用PBS洗3遍，加入1ml含酶抑制剂的DIGE裂解液，匀浆；转入离心管中，超声破碎细胞，12,000g离心45分钟，得上清蛋白样品；b、取各蛋白样品50μg，分别标记400pmol的不同染料分子，并进行双向电泳，电泳条件为pH值3-10NL，12.5%SDS-PAGE，用荧光扫描仪获得2D-DIGE图像，并基于此获得差异蛋白质点；2）取步骤1）a得到的蛋白样品1mg分别进行双向电泳，电泳条件为pH值3-10NL，12.5%SDS-PAGE，然后进行考马斯亮蓝染色，并切下差异蛋白质点，胶内酶解，MALDI-TOF-MS分析结果。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，用于分析的样本还包括梅山猪与野猪的杂交后代。2CCNN110222997702229978A说明书1/7页应用蛋白质组学技术筛选猪产仔数相关候选基因的方法技术领域[0001]本发明涉及基因的筛选方法，尤其涉及猪产仔相关候选基因的筛选方法。背景技术[0002]家畜一般都是从野生种经过若干年人工驯化而来，其许多重要的经济性状得到改善，例如生长速度、产仔数、肉质等等。[0003]家猪是大约在9000年前从野猪通过人工驯化而来，同样，在过去的几千年里，通过人工选择，许多重要经济性状得到改善，如生长速度、肉质、产仔数和抗病性等。例如，中国梅山猪的窝产仔数在18头以上，而中国野猪的窝产仔数只有大约8头。[0004]繁殖性状，尤其是产仔数，是降低猪肉生产成本的重要组成部分，因此有很多研究用来改善这些性状。猪窝产仔数多少直接影响养猪业的生产效益。据Chris(1996)计算，只要产仔数提高1头/胎，英国养猪业每年就可多获利7亿英镑，而整个欧共体则可多获纯利20亿欧元。在我国，如果母猪产仔数每胎提高1头，每年将增收至少190亿人民币的纯利，并能显著提供我国国民的蛋白食入量，改善人们的膳食结构，提供人民身体素质；同时，国内市场上猪肉的稳定和提高供应也成为我国粮食安全建设的重要内容；高繁殖力的遗传必将为我国国民经济快速发展起到积极的推动作用。[0005]如何提高猪的产仔数？传统上的人工选择是从猪出生后对其表型的观察用来筛选高产仔数的猪，这个表型是由于基因型和环境共同作用的结果。虽然已经取得了一些成果，由于产仔数的遗传力很低，大约为0.09，此外，这种表型的测定只有在猪很大的时候才能进行并且还有性别限制，因此传统的方法并没有得到充