一种筛选红莲型细胞质雄性不育水稻新型恢复基因的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN101899522A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN101899522A(43)申请公布日2010.12.01(21)申请号201010245020.7(22)申请日2010.08.03(71)申请人武汉大学地址430072湖北省武汉市武昌珞珈山(72)发明人李绍清谭艳平谢红卫(74)专利代理机构武汉宇晨专利事务所42001代理人王敏锋(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)A01H1/02(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图1页(54)发明名称一种筛选红莲型细胞质雄性不育水稻新型恢复基因的方法(57)摘要本发明公开了一种筛选红莲型细胞质雄性不育水稻新型恢复基因的方法，它包括下列步骤：首先是恢复基因共分离分子标记的引物设计与标准PCR扩增体系的建立；其次是分子标记扩增带型的比较分析，筛选具有差异分子标记的水稻品种或生态型；再次是利用遗传分析验证新的恢复基因位点，确定新型恢复基因。该方法将传统的遗传分析和分子遗传标记技术结合起来，有目的地发掘利用新的遗传基因资源。具有操作简便，快速准确，精确地选择新型恢复系的特点。有利于拓宽恢复谱，提高优良恢复基因的聚合选择效率，促进杂交水稻的结实率和产量及其可持续发展。CN108952ACN101899522A权利要求书1/1页1.一种筛选红莲型细胞质雄性不育水稻新型恢复基因的方法，它包括下列步骤：A、共分离分子标记的PCR引物设计：设计红莲型细胞质水稻恢复基因Rf5和Rf6共分离的分子标记引物，序列如下：引物P1：Rf5，53℃P1F：5’-ATGACAAATCTGCTCCGATG-3’P1R：5’-CTTACTTAGGAAAGACTAC-3’引物P2：Rf6，56℃P2F：5’-GGAGATGCTATAGCAGCAGTG-3’P2R：5’-ATTGCTCCTTACCACCTTGC-3’；B、PCR扩增反应体系的建立：标准的PCR扩增反应体系共15μl，组成如下：50ng/μl的总DNA1μl，10×PCRbuffer1.5μl，25mMMgCl20.6μl，25μmdNTP0.6μl，1U/μlTaq酶0.6μl，5pM的引物F1μl，5pM的引物R1μl，去离子ddH2O8.7μl：反应混合物用矿物油覆盖，PCR反应程序如下：1cycle：94℃5min30cycle：94℃1min；53或56℃1min；72℃1min1cycle：72℃5minstore：4℃；C、扩增DNA片段检测候选恢复位点：(a)、以含红莲恢复基因Rf5的密阳23和含Rf6的9311作对照，与恢复基因共分离的分子标记对所有检测水稻品种进行PCR扩增，扩增产物在3.5％(w/v)的琼脂糖胶上电泳；(b)、将检测品种扩增的带型分别与密阳23中Rf5、9311中Rf6共分离的分子标记带型进行比较：水稻品种分子标记的带型与红莲型恢复基因Rf5、Rf6带型不同，确定该品种携带与已知的红莲Rf5、Rf6不等位的新型候选恢复基因；D、遗传分析确证新型恢复基因：(1)将选择筛选的含差异标记的候选恢复系与红莲不育系粤泰A测交，套袋确定育性，测交组合，该候选恢复系含新型恢复基因R’；(2)将该候选新型恢复基因恢复系R’与Rf5亲本密阳23和Rf6亲本9311杂交，配制杂种F1，即：Rf5：R’/密阳23；Rf6：R’/9311；(3)以红莲不育系粤泰A作母本与相应的每个杂种F1测交，将测交组合种植150株的群体，观察育性分离，两个群体中都出现不育株，候选恢复系中所含的恢复基因与Rf5和Rf6不等位，属于新的恢复基因R’。2CN101899522A说明书1/6页一种筛选红莲型细胞质雄性不育水稻新型恢复基因的方法技术领域[0001]本发明涉及一种利用分子标记检测技术领域，更具体涉及一种快速定性检测红莲型细胞质的方法，适用于各种水稻栽培种、农家种和野生稻中水稻红莲型配子体细胞质雄性不育育性恢复基因的筛选。背景技术[0002]植物在漫长的进化过程中通过自然突变或重组在基因组内积累了大量的变异，从而导致同一种内不同株系或品系的差异。这种差异在遗传水平即表现为彼此间某些DNA片段的不同。当这种变异与某一特定的基因共分离时，即可作为该基因的特有的分子标签。如果将这些DNA片段通过体外扩增、电泳、显色，就会形成人们肉眼可见的具有不同大小的带型。这些不同品系间具有相对差异的带型即我们通常所说的分子标记，它对某一个品种而言，具有唯一性。利用分子标记进行品种选择或品种鉴定是当前植物生物技术育种的主要内容。它具有准确、快速、不受季节限制等优点，因而在生产中被广为采用。[0003]粮食问题是关系到国计民生的头等大事。水稻是我国最主要的粮食作物，目前，我国用仅占世界7％的耕地面积