一种抗猪蓝耳病的中药复方、提取方法、浓度和效果测定.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105596446A(43)申请公布日2016.05.25(21)申请号201610046350.0A61P31/14(2006.01)(2006.01)(22)申请日2016.01.22A61P37/04G01N33/50(2006.01)(71)申请人佛山科学技术学院地址528000广东省佛山市禅城区江湾一路18号(72)发明人王丙云冼琼珍刘樱陈志胜陈胜锋计慧琴(74)专利代理机构广州新诺专利商标事务所有限公司44100代理人许英伟(51)Int.Cl.A61K36/71(2006.01)A61K36/65(2006.01)权利要求书2页说明书5页(54)发明名称一种抗猪蓝耳病的中药复方、提取方法、浓度和效果测定(57)摘要本发明所述一种抗猪蓝耳病的中药复方、提取方法、浓度和效果测定，包含如下药物及其重量份：青蒿3份、穿心莲2份、板蓝根2份和赤芍1份，提取方法：水浸泡1h，浸泡加水量为中药复方重量4倍，然后再加入中药复方重量4倍的水量，煎煮20-30min，过滤得第一次煮液；再加入中药复方重量的5倍的水量，煎煮20min，过滤得第二次煮液；合并2次煮液，于烧杯中加热蒸煮，定容至20ml，每毫升相当于0.4g生药；置凉，用离心机以转速为3000r/min离心10min，取上层清液存200ml容量瓶中，用NaHCO3溶液调pH值至7.0，经高压灭菌分装于4℃保存备用。本发明具有扶正培本、调整机体阴阳平衡、增强免疫力、清热解毒、活血化瘀和固本解表等功效，能够直接或通过调节机体免疫力影响病毒的复制。CN105596446ACN105596446A权利要求书1/2页1.一种抗猪蓝耳病的中药复方，其特征在于，包含如下药物及其重量份：青蒿3份、穿心莲2份、板蓝根2份和赤芍1份。2.根据权利要求1所述一种抗猪蓝耳病的中药复方，其特征在于，按照配制8克中药复方为标准，包含如下药物及其重量比例：青蒿3克、穿心莲2克、板蓝根2克和赤芍1克。3.根据权利要求1或2所述一种抗猪蓝耳病的中药复方的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)按青蒿3g、穿心莲2g、板蓝根2g和赤芍1g，称取各中药，组成8g中药复方；(2)按照步骤(1)的配方称量配方药，水浸泡1h，浸泡加水量为中药复方重量的4倍，然后再加入中药复方重量4倍的水量，煎煮20-30min，过滤得第一次煮液；再加入中药复方重量的5倍的水量，煎煮20min，过滤得第二次煮液；(3)合并2次煮液，于烧杯中加热蒸煮，定容至20ml，每毫升相当于0.4g生药；(4)置凉，用离心机以转速为3000r/min离心10min，取上层清液存200ml容量瓶中，用NaHCO3溶液调pH值至7.0，经高压灭菌分装于4℃保存备用。4.根据权利要求1所述一种抗猪蓝耳病的中药复方的浓度测定，其特征在于，对Marc-145细胞安全浓度的测定：取Marc-145细胞长成单层的96孔培养板，弃原液，PBS洗涤1次，以DMEM完全培养液对中药原液作2倍倍比稀释至第10孔，每孔100μL，第11、12孔为细胞对照，各稀释度重复4孔，37℃、CO2培养箱培养至72h，每天观察细胞的形态变化及生长状况，72h后弃去培养液，以PBS液洗涤1次，加入MTT液20μL/孔，37℃继续培养4h后弃MTT液，加入DMSO150μL/孔，恒温振荡10min待结晶全部溶解，490nm波长下测定OD值；根据公式以OD值计算不同浓度复方中药对细胞的生长抑制率，细胞生长抑制率＝(细胞对照组OD值﹣药物组OD值)/细胞对照组OD值，并结合CPE观察结果来判断复方中药毒性的大小，当生长抑制率为0则表明该中药对细胞无毒性作用，结合复方中药的起始浓度，来确定其最大安全浓度。5.根据权利要求1所述一种抗猪蓝耳病的中药复方的浓度测定，其特征在于，猪蓝耳病病毒的半数毒性浓度(TCID50)的测定：将待测病毒按10倍比系列稀释至10-10，按100μL/孔的剂量加入长至单层Marc-145细胞的96孔板，最后2列作细胞对照组，各组重复8孔，37℃吸附1.5h后弃病毒液，各孔加入DMEM维持液100μL，CO2培养箱37℃培养；每天观察细胞病变作用(CPE)，72-96h后，以MTT法测定各孔OD值，根据下述公式计算：病毒对细胞的生长抑制率＝(细胞对照组OD值﹣病毒对照组OD值)/细胞对照组OD值，采用Reed-Muench两氏法，计算病毒的半数毒性浓度(TCID50)，即距离比例＝(高于50％的细胞生长抑制率-50％)/(高于50％的细胞生长抑制率-低于50％的细胞生长抑制率)，Log2TC50＝距离比例×稀释度对数之间的差+高于50％细胞生长抑制率的对数。6.根据权利要求4所述一种抗猪蓝耳