蛋白酶抑制剂BmSPI39及其制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102584987A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102584987A(43)申请公布日2012.07.18(21)申请号201210063271.2(22)申请日2012.03.12(71)申请人西南大学地址400715重庆市北碚区天生路2号(72)发明人赵萍李游山夏庆友向仲怀(74)专利代理机构北京同恒源知识产权代理有限公司11275代理人赵荣之(51)Int.Cl.C07K14/81(2006.01)C12N15/15(2006.01)C12N15/63(2006.01)C12N1/21(2006.01)C12N15/70(2006.01)A01K67/04(2006.01)权利要求书权利要求书11页页说明书说明书77页页序列表序列表44页页附图附图77页页(54)发明名称蛋白酶抑制剂BmSPI39及其制备方法和应用(57)摘要本发明公开了一个蛋白酶抑制剂BmSPI39，由SEQIDNo.2中第24位至第98位氨基酸组成，BmSPI39对温度和pH非常稳定，不仅能够强烈抑制枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K、球孢白僵菌体壁降解蛋白酶CDEP-1和蜂蜜曲霉蛋白酶的活性，并且能够阻断CDEP-1诱导的家蚕的过度、有害黑化，可用于制备枯草杆菌蛋白酶类蛋白酶抑制剂，也可用于制备CDEP-1诱导的杀虫性黑化反应的阻断剂，还可用于培育具有致病真菌抗性的家蚕品系，提高家蚕抵抗致病性真菌入侵的能力；此外，本发明的BmSPI39原核表达方法操作简单，表达量高。CN10258497ACN102584987A权利要求书1/1页1.蛋白酶抑制剂BmSPI39，由SEQIDNo.2中第25位至第98位氨基酸组成。2.根据权利要求1所述的蛋白酶抑制剂BmSPI39，其特征在于，在N末端还有信号肽序列，所述信号肽序列由SEQIDNo.2中第1位至第24位氨基酸组成。3.编码权利要求1所述蛋白酶抑制剂BmSPI39的基因。4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，由SEQIDNo.1中第96位至第320位核苷酸组成。5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于，在5’末端还有信号肽编码序列，由SEQIDNo.1中第24位至第95位核苷酸组成。6.根据权利要求5所述的基因，其特征在于，其cDNA全长序列由SEQIDNo.1中第1位至第440位核苷酸组成。7.含有权利要求3至6任一项所述基因的重组表达载体。8.根据权利要求7所述的重组表达载体，其特征在于，以p28质粒作为基础载体，所述p28质粒由pET28a质粒删减部分多克隆位点后获得，删减后的多克隆位点序列如SEQIDNo.10所示。9.含有权利要求7或8所述重组表达载体的工程菌。10.根据权利要求9所述的工程菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21(DE3)菌株为宿主菌。11.权利要求1所述蛋白酶抑制剂BmSPI39的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将由SEQIDNo.1中第96位至第320位核苷酸组成的基因克隆入p28质粒的多克隆位点，获得重组表达载体BmSPI39-p28，再将重组表达载体BmSPI39-p28转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，获得工程菌BmSPI39-p28-BL21(DE3)，再用终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷于37℃诱导表达5小时，收集诱导表达后的菌体，超声破碎，离心，收集上清，用Ni2+-NTA亲和层析纯化，即制得蛋白酶抑制剂BmSPI39；所述p28质粒由pET28a质粒删减部分多克隆位点后获得，删减后的多克隆位点序列如SEQIDNo.10所示。12.权利要求1所述的蛋白酶抑制剂BmSPI39和权利要求3所述的基因在制备枯草杆菌蛋白酶类蛋白酶抑制剂中的应用。13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述枯草杆菌蛋白酶类蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K、球孢白僵菌体壁降解蛋白酶CDEP-1和蜂蜜曲霉蛋白酶。14.权利要求1所述的蛋白酶抑制剂BmSPI39和权利要求3所述的基因在制备球孢白僵菌体壁降解蛋白酶CDEP-1诱导的杀虫性黑化反应阻断剂中的应用。15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述CDEP-1诱导的杀虫性黑化反应为CDEP-1诱导的家蚕黑化反应。16.权利要求3所述的基因在培育具有致病真菌抗性的家蚕品系中的应用。2CN102584987A说明书1/7页蛋白酶抑制剂BmSPI39及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种蛋白酶抑制剂及其制备方法和应用。背景技术[0002]家蚕是一种具有很高经济价值的产丝昆虫。然而，家蚕易受各种病原微生物和其它外界因素影响，产生疾病。昆虫致病性真菌，如绿僵菌、球孢白僵菌、黄曲霉菌和米曲霉菌，都可引发高传染性蚕病。一旦这些致病性真菌