水蛭素突变体的提取纯化方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109957008A(43)申请公布日2019.07.02(21)申请号201910301614.6C07K1/16(2006.01)(22)申请日2019.04.16C12P21/02(2006.01)A61J1/05(2006.01)(71)申请人广东双骏生物科技有限公司A61J1/14(2006.01)地址515071广东省汕头市汕头保税区C03C12R1/19(2006.01)地块双骏生物科技园(72)发明人陈杰鹏段丽丽陈鸿锐胡留松陈煜藩洪琳许志锴叶红林纪烨瑜蔡春丽(74)专利代理机构北京安信方达知识产权代理有限公司11262代理人凌翠张奎燕(51)Int.Cl.C07K14/815(2006.01)C07K1/36(2006.01)C07K1/34(2006.01)权利要求书2页说明书15页附图2页(54)发明名称水蛭素突变体的提取纯化方法及其应用(57)摘要本申请公开了一种从大肠杆菌发酵生产水蛭素突变体HV2-Lys47的发酵液中提取纯化水蛭素突变体HV2-Lys47的方法，所述方法采用膜技术及一次柱层析技术，从而获得高纯度的水蛭素突变体HV2-Lys47。本申请还公开了由此制备的水蛭素突变体HV2-Lys47在抗凝采血管中的应用及包含水蛭素突变体HV2-Lys47的抗凝采血管。CN109957008ACN109957008A权利要求书1/2页1.一种从大肠杆菌发酵生产水蛭素突变体HV2-Lys47(SEQIDNO.:1)的发酵液中提取纯化水蛭素突变体HV2-Lys47的方法，包括以下步骤：在升高的温度下处理大肠杆菌发酵液，以灭菌且去除杂蛋白；通过陶瓷膜或通过离心机来处理灭菌的发酵液，以去除菌体；可选地，通过超滤膜来处理通过陶瓷膜或离心机的发酵液，以去除杂蛋白；通过纳滤膜来处理通过陶瓷膜或离心机的发酵液、或通过超滤膜的发酵液，以获得粗分离的浓缩液；将盐添加到所述粗分离的浓缩液中作为辅料，喷雾干燥，得到干粉；将所述干粉溶解在水中并过滤除杂，可选地通过滤纸、砂芯漏斗或膜设备来进行过滤；使滤液仅通过分子筛柱层析1次，用水洗脱，浓缩收集液，得到水蛭素突变体HV2-Lys47粗品；将所述水蛭素突变体HV2-Lys47粗品溶解到水中，然后向其中添加盐或有机溶剂，以沉淀出水蛭素突变体HV2-Lys47，干燥即得水蛭素突变体HV2-Lys47纯品，可选地进行真空干燥，更可选地进行冷冻真空干燥。2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过离心机来处理高温灭菌的发酵液，可选地所述离心机为管式离心机或碟式离心机。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述高温处理是在65℃-67℃下保持5-20分钟，可选地10分钟。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述盐选自氯化钠、氯化钾、硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾中的一种或更多种。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分子筛柱层析选自由sephadexG25、sephadexG50、sephadexG75和sephadexG100组成的组。6.根据权利要求1所述的方法，其中，浓缩经由分子筛柱层析得到的收集液是通过减压真空浓缩、纳滤膜浓缩或反渗透膜浓缩来进行的。7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述有机溶剂选自乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇或乙腈中的一种或更多种。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，作为辅料添加的盐的以克计的重量为粗分离的浓缩液的以毫升计的体积的5％或更大。9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，用于溶解所述干粉的水的以毫升计的体积为所述干粉的以克计的重量的10倍以上。10.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，为了使水蛭素突变体HV2-Lys47沉淀，所添加的盐的以克计的重量为溶解有水蛭素突变体HV2-Lys47粗品的水溶液的以毫升计的体积的20％-30％，所添加的有机溶剂的体积为溶解有水蛭素突变体HV2-Lys47粗品的水溶液的体积的5-9倍。11.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述大肠杆菌发酵液是通过以pBH-2为表达载体的菌株大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)pBH2CGMCCNo0908培养生产的，可选地，所述培养包括在需氧条件下，在25℃-35℃的温度下培养至对数生长期结束，然后升温至35℃-45℃继续培养至水蛭素突变体HV2-Lys47的产量达到峰值。12.一种水蛭素突变体HV2-Lys47，所述水蛭素突变体HV2-Lys47根据权利要求1-11中2CN109957008A权利要求书2/2页任一项所述的方法来生产。13.如权利要求12所述的水蛭素突变体HV2-Lys47，所述水蛭素突变体HV2-Lys47的抗凝活性为大于或等于18000ATU/mg。14.水