嗜热子囊菌光孢变种61家族内切纤维素酶eg基因克隆及其编码蛋白.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN101880682A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN101880682A(43)申请公布日2010.11.10(21)申请号201010186704.4(22)申请日2010.05.31(83)生物保藏信息CGMCCNo.38042010.05.10(71)申请人山东农业大学地址271018山东省泰安市岱宗大街61号(72)发明人李多川李安娜韩华(51)Int.Cl.C12N15/56(2006.01)C12N9/42(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表4页附图0页(54)发明名称嗜热子囊菌光孢变种61家族内切纤维素酶eg基因克隆及其编码蛋白(57)摘要本发明是以嗜热子囊菌光孢变种Thermoascusaurantiacusvar.levisporuscDNA为模版，以由原始菌株纯化的纤维素酶N端序列及61家族纤维素酶保守位点设计兼并引物，扩增纤维素酶中间片段，后以3’RACE、5’TAIL-PCR的方法得到内切葡聚糖酶eg基因全长cDNA序列及推导的氨基酸序列。克隆该基因对该家族纤维素酶的催化核心、作用机制、空间结构等的研究具有重要意义。嗜热真菌纤维素酶具热稳定性，用于转化纤维废料及其它工业领域，具有经济价值和社会价值。CN10862ACN101880682A权利要求书1/1页1.嗜热子囊菌光孢变种Thermoascusaurantiacusvar.levisporus61家族内切纤维素酶eg基因，其特征在于：是SEQIDNO.1所示的碱基序列。2.嗜热子囊菌光孢变种Thermoascusaurantiacusvar.levisporus61家族内切纤维素酶eg基因编码蛋白，其特征在于：是SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。2CN101880682A说明书1/4页嗜热子囊菌光孢变种61家族内切纤维素酶eg基因克隆及其编码蛋白(一)技术领域[0001]本发明涉及生物工程，具体地说是以嗜热子囊菌光孢变种Thermoascusaurantiacusvar.levisporuscDNA为模版，以由原始菌株纯化的纤维素酶N端序列及61家族纤维素酶保守位点设计兼并引物，扩增纤维素酶中间片段，后以3’RACE、5’TAIL-PCR的方法得到内切葡聚糖酶eg基因全长cDNA序列及推导的氨基酸序列。(二)背景技术[0002]纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的物质，是第一大可再生资源。纤维素的生物降解是通过纤维素酶实现的。纤维素酶是一个复合酶系，包括内切-β-1，4-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)(EG)、β-1，4-纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)(CBH)及β-1，4-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)(BGL)。这三种酶协同作用，彻底切割β-1，4-糖苷键，使纤维素最终降解为葡萄糖。其中内切-β-1，4-葡聚糖酶是纤维素酶系最主要的成分，它首先作用纤维素，水解纤维素链非结晶区的β-1，4-糖苷键将纤维素链打开，它对整个纤维素的降解起重要的作用。纤维素酶属于糖苷水解酶类，根据氨基酸序列的同源性以及纤维素酶结构的相似性，将其分成不同的家族，可以反映酶的结构特点，揭示酶的进化关系，并且可以推断酶的作用机理。目前为止，在嗜热真菌中61家族纤维素酶未见报道，克隆该基因对该家族纤维素酶的催化核心、作用机制、空间结构等的研究具有重要意义。[0003]纤维素酶广泛应用于轻工、医药、环保、食品加工、饮料工业、纺织工业、可再生资源的综合利用等方面，被认为是最有应用潜力的酶制剂之。目前国内外纤维素酶主要由嗜温真菌曲霉和木霉生产，但存在菌种产酶量低、活力低、酶稳定性差及成本高等问题，使其纤维素酶的生产和应用受到很大限制。由于热稳定纤维素酶在高温条件下的热稳定，因此具有重要应用前景和商业价值。[0004]嗜热子囊菌光孢变种Thermoascusaurantiacusvar.levisporus是一种广泛分布于土壤中的嗜热真菌。该菌在微晶纤维素为唯一碳源的培养基中50℃条件下可以产生热稳定的纤维素酶。(三)发明内容[0005]本发明从嗜热子囊菌光孢变种Thermoascusaurantiacusvar.levisporus获得内切β-1，4-葡聚糖酶基因的全长cDNA序列，命名为eg，eg基因cDNA全长1325bp，包括起始密码子和多聚A尾，具有一个747bp的开放阅读框，编码249个氨基酸。具有信号肽序列(1-21aaMSFSKIIATAGVLASASLVAG)及一个潜在的N糖基化位点(NNS)。[0006]将eg编码的氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现属于糖苷水解酶第61家族，其中3个基序GNYV-RHE，GAQNYPQC和Y-IPGP具保守性。[0007]DNAMAN分析其分子量