一种新型木聚糖酶(Xyn10A)基因的克隆、表达和纯化.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102127556A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102127556A(43)申请公布日2011.07.20(21)申请号201010581342.9(22)申请日2010.12.10(71)申请人江南大学地址214122江苏省无锡市蠡湖大道1800号(72)发明人邬敏辰汪俊卿张慧敏李剑芳(51)Int.Cl.C12N15/56(2006.01)C12N9/42(2006.01)C12N15/10(2006.01)C12N15/09(2006.01)权利要求书2页说明书5页序列表5页附图1页(54)发明名称一种新型木聚糖酶(Xyn10A)基因的克隆、表达和纯化(57)摘要本发明提出了一种源自宇佐美曲霉(Aspergillususamii)E001菌株的新型木聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆方法，其核苷酸序列分别为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2。生物信息学分析表明该木聚糖酶属于糖苷水解酶第10家族，命名为AusXyn10A，其氨基酸序列为SEQIDNO：3，相应的基因命名为Ausxyn10A。本发明还公开了木聚糖酶工程菌的构建以及重组木聚糖酶的高效表达和纯化的方法。作为一种新型酶制剂，该木聚糖酶具有较大的工业化生产潜力和经济价值。CN102756ACCNN110212755602127561A权利要求书1/2页1.一种源自宇佐美曲霉(Aspergillususamii)E001、归属于糖苷水解酶第10家族的新型木聚糖酶基因，其完整mRNA和DNA的核苷酸序列分别对应于序列表中的SEQIDNO：1和SEQIDNO：2。2.如权利要求1所述的新型木聚糖酶(AusXyn10A)，其氨基酸序列为SEQIDNO：3。3.A.usamiiE001Ausxyn10A完整mRNA和DNA序列的获取方法：(1)A.usamiiE001Ausxyn10A3′端mRNA序列的克隆：对10家族的AspergillusnigerDMS、AspergilluskawachiiIFO和AspergillusnigerIME木聚糖酶的氨基酸序列进行同源比对，设计一条简并引物Xyn10A-F1；Xyn10A-F1：5′-ATGGTTCAGATCAAGG(C/T)AGC-3′以A.usamiiE001总RNA为模板，OligodT-AdaptorPrimer为引物反转录合成cDNA的第一条链；以M13PrimerM4和Xyn10A-F1为引物进行PCR扩增(94℃2min；30个循环，94℃30s，53℃30s，72℃1min；72℃10min)；目的条带经克隆、测序，得到Ausxyn10A3′端mRNA序列；(2)A.usamiiE001Ausxyn10A5′端mRNA序列的克隆：基于上述得到的Ausxyn10A3′端mRNA序列，，设计两条反向引物Xyn10A-R1和Xyn10A-R2；Xyn10A-R1：5′-GTTCAGTAGCATCCCACTTC-3′Xyn10A-R2：5′-CGGAGTCTTCGAGTTCTTGG-3′以反转录合成的cDNA第一条链为模板、5′RACEOuterPrimer和Xyn10A-R1为引物进行第一轮PCR(94℃3min；30个循环，94℃30s，55℃30s，72℃30s；72℃10min)；以5′RACEInnerPrimer和Xyn10A-R2为引物进行第二轮PCR(94℃3min；30个循环，94℃30s，55℃30s，72℃30s；72℃10min)；目的条带经克隆、测序，得到Ausxyn10A5′端mRNA序列；(3)A.usamiiE001Ausxyn10A5′端启动子序列的克隆：以经处理的A.usamiiE001基因组DNA为模板，以HSOF和Xyn10A-R1为引物进行第一轮PCR(94℃4min；30个循环，94℃30s，55℃30s，72℃1min；72℃10min)；以HSOF和Xyn10A-R2为引物进行第二轮PCR(94℃4min；30个循环，94℃30s，55℃30s，72℃1min；72℃10min)；目的条带经克隆、测序，得到Ausxyn10A5′端启动子序列；(4)A.usamiiE001Ausxyn10A3′端转录终止区序列的克隆：基于上述得到的Ausxyn10A3′端mRNA序列，设计两条正向引物Xyn10A-F2和Xyn10A-F3；Xyn10A-F2：5′-CCGTTTGGGGAGTTGCTGAC-3′Xyn10A-F3：5′-TCCACTCCTCTGCTGTTCG-3′以HSOF和Xyn10A-F2为引物进行第一轮PCR(94℃4min；30个循环，94℃30s，55℃30s，72℃1min；72℃10min