一种柑橘黄龙病病原PCR检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103525943103525943A(43)申请公布日2014.01.22(21)申请号201310532794.1(22)申请日2013.11.01(71)申请人广西壮族自治区农业科学院园艺研究所地址530007广西壮族自治区南宁市大学东路174号(72)发明人黄宏明廖惠红王茜徐宁(74)专利代理机构北京中誉威圣知识产权代理有限公司11279代理人彭晓玲(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12Q1/04(2006.01)权权利要求书1页利要求书1页说明书7页说明书7页附图1页附图1页(54)发明名称一种柑橘黄龙病病原PCR检测方法(57)摘要本发明涉及生物检测鉴定方法，尤其涉及柑橘黄龙病病原PCR检测方法。一种柑橘黄龙病病原PCR检测方法，包括待检样品DNA提取；配制PCR扩增体系，所述的扩增体系包括第一轮PCR扩增体系和第二轮PCR扩增体系；PCR扩增反应；PCR扩增产物检测，其中所述的第一轮和第二轮PCR扩增体系最终体积为7μL～10μL，其中DNA模板2.5μL、2×TaqPCRMasterMix2.5μL、引物0.25μL，其余为灭菌双蒸水。本发明的第一轮和第二轮各自PCR扩增总反应体系均为7μL～10μL，可达到20或25μL反应体系检测出来的效果，大幅度降低了检测经济成本；本发明所需的试剂量少，能减轻对环境的污染。CN103525943ACN1035294ACN103525943A权利要求书1/1页1.一种柑橘黄龙病病原PCR检测方法，包括如下步骤：(1)待检样品DNA提取；(2)配制PCR扩增体系，所述的扩增体系包括第一轮PCR扩增体系和第二轮PCR扩增体系；(3)PCR扩增反应；(4)PCR扩增产物检测，其特征在于：所述的第一轮和第二轮PCR扩增体系最终体积为7μL～10μL，其中DNA模板2.5μL、2×TaqPCRMasterMix2.5μL、引物0.25μL，余量为灭菌双蒸水。2.根据权利要求1所述的柑橘黄龙病病原PCR检测方法，其特征在于：所述的待检样品DNA的OD260/OD280值为1.7～1.9。3.根据权利要求1或2所述的柑橘黄龙病病原PCR检测方法，其特征在于：所述的第一轮PCR扩增体系中，DNA模板由待检样品DNA稀释100倍体积后制得。4.根据权利要求1所述的柑橘黄龙病病原PCR检测方法，其特征在于：所述的2×TaqPCRMasterMix不含染料，其中dATP、dCTP、dGTP、dTTP浓度相同，为0.4mmol/L；Mgcl2浓度为4mmol/L；Taq酶和PfuDNA聚合酶总浓度为0.05U/μL。5.根据权利要求1所述的柑橘黄龙病病原PCR检测方法，其特征在于：所述的第一轮PCR扩增体系中，使用的引物为柑橘黄龙病亚洲种的16SrDNA引物，所述引物为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2，序列表信息如下所示：SEQIDNO:1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′SEQIDNO:2：5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′。6.根据权利要求1所述的柑橘黄龙病病原PCR检测方法，其特征在于：所述的第二轮PCR扩增体系中，使用的引物为柑橘黄龙病亚洲种的16SrDNA引物，所述引物为SEQIDNO:3和SEQIDNO:4，序列表信息如下所示：SEQIDNO:3：5′-GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA-3′SEQIDNO:4：5′-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3′。7.根据权利要求1或5所述的柑橘黄龙病病原PCR检测方法，其特征在于：所述的第一轮PCR扩增体系中，引物SEQIDNO:1和SEQIDNO:2浓度相同，为5μmol/L，两条引物体积比为1:1。8.根据权利要求1或6所述的柑橘黄龙病病原PCR检测方法，其特征在于：所述的第二轮PCR扩增体系中，引物SEQIDNO:3和SEQIDNO:4浓度相同，为5μmol/L，两条引物体积比为1:1。9.根据权利要求1或2所述的柑橘黄龙病病原PCR检测方法，其特征在于：所述的第二轮PCR扩增体系中，DNA模板由第一轮PCR产物稀释20倍体积后制得。10.根据权利要求1所述的柑橘黄龙病病原PCR检测方法，其特征在于：所述的PCR扩增反应包括第一轮扩增反应和第二轮扩增反应，第一轮PCR扩增反应条件为94℃预变性4min，94℃变性45sec，58℃退火30sec，72℃延伸45sec，35个循环，72℃最后延伸7min；第二轮PCR扩增反应条件为94℃预变性4min，94℃变性45sec，55℃退火30sec，72℃延伸45sec，35个循环，72℃最后延伸7min。2