一种定量鉴别浙贝母的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105861663A(43)申请公布日2016.08.17(21)申请号201610235408.6(22)申请日2016.04.15(71)申请人广西壮族自治区梧州食品药品检验所地址543000广西壮族自治区梧州市西环路中段198号(72)发明人陈学松罗达龙黄林杰黄琳(74)专利代理机构广州市越秀区海心联合专利代理事务所(普通合伙)44295代理人黄为蔡国(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图2页(54)发明名称一种定量鉴别浙贝母的方法(57)摘要本发明提供了一种定量鉴别浙贝母的方法，旨在提供一种鉴别准确率高、专属性强的定量鉴别浙贝母的方法，该方法依次包括下述步骤：1)引物的稀释；2)样品的前处理；3)DNA的提取；4)PCR反应液的配制；5)加模板；6)罗氏LightCycler96荧光定量PCR仪上机；7)数据处理；8)结果判定；属于化学检测技术领域。CN105861663ACN105861663A权利要求书1/1页1.一种定量鉴别浙贝母的方法，其特征在于，依次包括下述步骤：1)引物的稀释每管加超纯水0.29ml来稀释配制工作浓度为10μM的引物，将稀释好的引物涡旋振荡混匀使其充分溶解，放-20℃冰箱保存备用；2)样品的前处理取1g试样，用研钵研成粉末，称取20mg至1.5mL或2ml灭菌离心管中；3)DNA的提取取前处理好的样品，采用磁珠法用核酸提取仪提取DNA，提取到的试样DNA置-20℃保存备用；3)PCR反应液的配制依次称取下述物质：2x荧光定量预混试剂彩色版10μl；5-ACAGTACTGGGGGAGAAGTC-30.5μl；5-CAAATGGAGGGTATGTGTCG-30.5μl，无RNA酶水7μl，将各个试剂加入至干净的离心管中，涡旋振荡混匀后，放冰盒上待用，取出干净灭菌的PCR八联管固定在PCR管盒上，将冰盒上的反应液短暂离心后，轻轻打开盖子，往PCR管中分装反应液，每管18μl，管中尽量避免气泡的存在；4)加模板往上述含有反应液的PCR管中加入2μl提取好的DNA，轻轻敲打PCR管盒，使反应液与DNA混匀，并经3000转离心数30S，立即进行PCR反应；6)罗氏LightCycler96荧光定量PCR仪上机；7)数据处理将数据同步至电脑上，设置阴性对照、阳性对照、检品类型；选择定性检测对试样进行分析；8)结果判定阴性对照需无Cq值，曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增长期；阳性对照需Cq≤30，曲线有明显指数扩增期；样品若无Cq值，曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增长期，可判为非浙贝母；样品若Cq值≤36，曲线有明显指数扩增期，可判为浙贝母。2.根据权利要求1所述的定量鉴别浙贝母的方法，其特征在于，所述罗氏LightCycler96荧光定量PCR仪上机设置方法为：检测模式为荧光通道，反应总体积为20μl，染色选择DNA荧光染料，依次选择预变性、三步扩增，最后选择单通道收集荧光。3.根据权利要求1所述的定量鉴别浙贝母的方法，其特征在于，所述PCR反应参数为95℃、4min1个循环；95℃、30s，60℃，30s，72℃，60s，45个循环。2CN105861663A说明书1/5页一种定量鉴别浙贝母的方法技术领域[0001]本发明提供一种对浙贝母的鉴别方法，具体的说，实时荧光定量PCR对浙贝母的鉴别方法；属于化学检测技术领域。背景技术[0002]浙贝母为百合科植物浙贝母(FritillariathunbergiiMiq.)的干燥鳞茎，为浙江重要道地中药材“浙八味”之一，具有清热化痰止咳、解毒散结消痈的功效，药用价值较高。传统的浙贝母的鉴别，主要是性状、显微鉴别，由于市场上贝母类药材品种较多，相同品种间也会因为药源植物来源不一、种植环境、产地和加工等因素存在相当的混杂度，这就使得实验人员必须具备较高的药材鉴别经验。随着分子生物学技术的发展，使得中药材的分子遗传标记鉴别成为可能。目前文献上已有聚合酶链式反应(PCR)法鉴别浙贝母药材的相关报道。发明内容[0003]针对上述不足，本发明的目的是提供一种通过磁珠法提取浙贝母中的DNA，利用PCR荧光探针法来鉴别，较普通PCR法操作简单、时间短、准确率高、环保。[0004]一种定量鉴别浙贝母的方法，依次包括下述步骤：[0005]1)引物的稀释[0006]每管加超纯水0.29ml来稀释配制工作浓度为10μM的引物，将稀释好的引物涡旋振荡混匀使其充分溶解，放-20℃冰箱保存备用；[0007]2)样品的前处理[0008]取1g试样，用研钵研成粉末，称取20mg至1.5mL或2ml灭菌离心管中；[0009]3)DNA的提取[0010]取前处理好的样品，采