一种烟叶中玉米素核苷固相萃取-液相色谱-串联质谱的测定方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109324140A(43)申请公布日2019.02.12(21)申请号201811538575.3G01N30/06(2006.01)(22)申请日2018.12.14G01N30/14(2006.01)G01N30/54(2006.01)(71)申请人广西中烟工业有限责任公司G01N30/72(2006.01)地址530001广西壮族自治区南宁市西乡塘区北湖南路28号(72)发明人许蔼飞刘鸿陈志燕黄世杰范忠周芸王萍娟孟冬玲朱静周晓徐雪芹吴晶晶陆冰琳唐桂芳蒋宏霖周奕韦入丹陈瑶(74)专利代理机构北京三聚阳光知识产权代理有限公司11250代理人李红团(51)Int.Cl.G01N30/02(2006.01)权利要求书2页说明书5页附图1页(54)发明名称一种烟叶中玉米素核苷固相萃取-液相色谱-串联质谱的测定方法(57)摘要一种烟叶中玉米素核苷固相萃取－液相色谱－串联质谱的测定方法，包括以下步骤：以甲醇：水：甲酸溶液(80：19.9：0.1，V/V/V)作为提取液，烟叶样品经低温浸提后，浸提液经C18固相萃取小柱净化，洗脱液氮吹近干，甲醇复溶后经有机滤膜过滤，采用高效液相色谱－串联质谱联用法测定烟叶中的玉米素核苷，内标法定量。本发明的特点是：采用同位素稀释内标法定量避免了分析过程中基质效应的影响；本方法前处理简单，可快速、准确检测烟叶中玉米素核苷的含量，且重复性和回收率好，适用于大批量样品的分析。CN109324140ACN109324140A权利要求书1/2页1.一种烟叶中玉米素核苷固相萃取－液相色谱－串联质谱的测定方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：(1)提取液的制备：使用甲醇、水和甲酸，配制甲醇：水：甲酸溶液(80：19.9：0.1，V/V/V)作为提取液；(2)内标储备液配制：用甲醇配制氘代玉米素核苷(d2－ZR)内标储备液，浓度为20μg/mL；(3)标准储备液配制：用甲醇配制玉米素核苷(ZR)标准储备液，浓度为100μg/mL；(4)样品前处理及分析：新鲜烟叶样品在液氮下研磨后储存于－50℃冰箱中备用；称取处理后的烟叶样品于15mL离心管中，加入内标储备液和提取液，匀质化5min，低温浸提，浸提液经离心后，定量移取上清液，加水定容，混匀，全部过固相萃取小柱，上柱后，用甲醇水溶液淋洗固相萃取小柱，后再用甲醇水溶液进行洗脱，洗脱液氮吹至近干，最后用甲醇复溶约至0.5mL，过有机滤膜后，样品进行LC－MS/MS测定；(5)标准曲线的绘制：使用空白样品液稀释标准储备液配成系列浓度为2、10、20、50、100、500、1000ng/mL的7级工作标准溶液；ZR及d2－ZR采用正离子模式，对上述系列标准溶液进行LC－MS/MS测定，以目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度比值进行线性回归分析，求得玉米素核苷的标准曲线；(6)数据处理与检测：由目标峰面积与内标峰面积之比进行内标法定量。2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述称取处理后的烟叶样品量与加入提取液的体积比为1：10(g/mL)。3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述内标储备液中的标准物质为氘代玉米素核苷(d2－ZR)。4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述内标储备液和提取液的加入量分别为50μL和10mL。5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述称取处理后的烟叶样品量为1g。6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述低温浸提的浸提时间为12h，浸提温度为4℃。7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述离心操作条件为：离心转速为10000r/min，离心时间为3min，离心温度为4℃。8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述移取上清液的量为2mL，加水量为8mL。9.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述固相萃取小柱为C18固相萃取小柱，规格为：500mg/6mL，使用前事先分别用6mL甲醇活化和6mL水平衡小柱。10.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述淋洗固相萃取小柱的甲醇水溶液的浓度为20％(V/V)，使用量为6mL；所述进行洗脱用的甲醇水溶液浓度为80％(V/V)，使用量为6mL。11.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述有机滤膜为0.22μm聚四氟乙烯滤膜。12.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：在步骤(4)或(5)中，所述LC－MS/MS2CN109324140A权利要求书2/2页测定时，高效液相色谱条件为：色谱柱：