一种蛋白卵磷脂化修饰的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109422796A(43)申请公布日2019.03.05(21)申请号201710786719.6C07K14/795(2006.01)(22)申请日2017.09.04C07K16/00(2006.01)C07K14/62(2006.01)(71)申请人北京泰德制药股份有限公司C12N9/02(2006.01)地址100176北京市大兴区经济技术开发C12N9/64(2006.01)区荣京东街8号C12N9/26(2006.01)(72)发明人齐连权常翠云李辰霄孙涛C12N9/40(2006.01)贾慧C12N9/16(2006.01)(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限C12N9/24(2006.01)公司11227代理人刘伟赵青朵(51)Int.Cl.C07K1/107(2006.01)C07K1/18(2006.01)C07K1/34(2006.01)C07K14/765(2006.01)权利要求书1页说明书11页附图3页(54)发明名称一种蛋白卵磷脂化修饰的方法(57)摘要本发明属于蛋白质医药生物工程与技术领域，公开了一种蛋白卵磷脂化修饰的方法。该方法将含无机盐的缓冲体系、被修饰蛋白、磷脂酰胆碱活性酯的有机溶液在4℃-30℃下混匀，静置修饰0.1h～96h。本发明所述蛋白卵磷脂化修饰的方法可以提高蛋白卵磷脂化修饰的效率，同时提高修饰后的卵磷脂化蛋白的收率和纯度。CN109422796ACN109422796A权利要求书1/1页1.一种蛋白卵磷脂化修饰的方法，其特征在于，将含无机盐的缓冲体系、被修饰蛋白、磷脂酰胆碱活性酯的有机溶液在4℃-30℃下混匀，静置修饰0.1h～96h。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含无机盐的缓冲体系中所述缓冲体系选自磷酸缓冲体系(PB)、硼酸缓冲体系、柠檬酸钠缓冲体系、乙酸钠缓冲体系、tris盐酸缓冲体系，pH值为6～9；所述无机盐选自氯化钾、氯化钠、硫酸铵、硫酸钠，浓度为5～100mM；所述溶解磷脂酰胆碱活性酯的有机溶剂选自异丙醇、丙酮、甲醇、乙醇、正丁醇、N,N-二甲基乙酰胺、环丁砜、二甲基亚砜、聚乙二醇；所述有机溶剂的浓度为10％-99.99％。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷脂酰胆碱活性酯与被修饰蛋白的质量比为(0.12～2.0):1；按g/L计，所述含无机盐的缓冲体系、溶解磷脂酰胆碱活性酯的有机溶剂的体积比为(0.75-0.1):(0.1-0.75)。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述被修饰蛋白为含有游离伯胺基团的蛋白。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述修饰温度为15℃-25℃，所述修饰时间为2h～36h。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混匀按照下述一种顺序加入：(1)依次按照含无机盐的缓冲体系、磷脂酰胆碱活性酯的有机溶液、被修饰蛋白的顺序加入后混匀；(2)依次按照被修饰蛋白、含无机盐的缓冲体系、磷脂酰胆碱活性酯的有机溶液的顺序加入后混匀；(3)依次按照磷脂酰胆碱活性酯的有机溶液、含无机盐的缓冲体系、被修饰蛋白的顺序加入后混匀；(4)依次按照含无机盐的缓冲体系、被修饰蛋白、磷脂酰胆碱活性酯的有机溶液的顺序加入后混匀。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述混匀具体为将含无机盐的缓冲体系与被修饰蛋白混合以30rpm-600rpm的搅拌速度搅拌均匀，然后以10ml/min～120ml/min的速度流加磷脂酰胆碱活性酯的有机溶液，完全加入后以30rpm-600rpm的搅拌速度搅拌均匀。8.根据权利要求1-7任意一项所述的方法，其特征在于，还包括离子交换柱层析纯化和用含无机盐的缓冲体系超滤置换有机溶剂的步骤。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述离子交换柱层析纯化的层析柱填料为阴离子交换填料或阳离子交换填料；所述纯化具体为将修饰后的蛋白溶液装入层析柱后，使用流动相A溶液进行初步清洗，再用流动相B溶液进行洗脱收集，所述流动相A由含浓度为5～100mM的无机盐的缓冲液和乙醇组成，乙醇比例为30％～70％，缓冲液pH值为6～9，所述流动相B由含浓度为100～400mM的无机盐的缓冲液和乙醇组成，乙醇比例为30％～70％，缓冲液pH值为6～9。10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述含无机盐的缓冲体系超滤置换有机溶剂的步骤中置换方法为中空纤维超滤或切向流膜包超滤，所述含无机盐的缓冲体系中无机盐浓度为5～100mM，缓冲体系pH为6～9。2CN109422796A说明书1/11页一种蛋白卵磷脂化修饰的方法技术领域[0001]本发明属于蛋白质医药生物工程与技术领域，具体涉及一种蛋白卵磷脂化修饰的方法。背景技术[0002]现代生