一种纯化副猪嗜血杆菌血清4型和血清5型的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110066751A(43)申请公布日2019.07.30(21)申请号201910370173.5C12R1/21(2006.01)(22)申请日2019.05.06(71)申请人江苏南农高科技股份有限公司地址214405江苏省无锡市江阴市锡澄路890号(72)发明人缪芬芳肖澄董彦鹏徐凤胡静雅郁伟军车巧林周琳耿晓眉谢洁(74)专利代理机构北京卓岚智财知识产权代理事务所(特殊普通合伙)11624代理人任漱晨(51)Int.Cl.C12N1/20(2006.01)C12N1/02(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图2页(54)发明名称一种纯化副猪嗜血杆菌血清4型和血清5型的方法(57)摘要本发明涉及抗原物质纯化技术领域，具体涉及一种纯化副猪嗜血杆菌血清4型和血清5型的方法，以抗原培养液及灭活抗原培养物作为原料，先后经超滤浓缩、洗滤两步处理，本技术方案利用中空纤维膜剪切力低、过程控制简单的特点，并优化了操作条件，通过跨膜压、剪切速率的限定保证了抗原自身稳定，并确保了杂质去除率。应用本方法纯化副猪嗜血杆菌血清4型、血清5型，6倍浓缩后杂蛋白的去除率达90％以上，抗原回收率在60％以上，血清含量、内毒素含量与原抗原液相比明显降低。同时，由于本方法处理量大，处理速度快、操作简单、工艺稳定，因此可以实现自动化或半自动化生产。CN110066751ACN110066751A权利要求书1/1页1.一种纯化副猪嗜血杆菌血清4型和血清5型的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将副猪嗜血杆菌血清4型或血清5型抗原液进行超滤浓缩；(2)将步骤(1)所得产物用体积3-8倍的缓冲液进行洗滤，收集产物。2.根据权利要求1所述的一种纯化副猪嗜血杆菌血清4型和血清5型的方法，其特征在于，步骤(1)所述的副猪嗜血杆菌血清4型和血清5型抗原液，包括副猪嗜血杆菌血清4型、5型活抗原或灭活的副猪嗜血杆菌血清4型、5型抗原。3.根据权利要求1所述的一种纯化副猪嗜血杆菌血清4型和血清5型的方法，其特征在于，步骤(1)所述超滤浓缩，利用中空纤维膜过滤系统进行浓缩。4.根据权利要求3所述的一种纯化副猪嗜血杆菌血清4型和血清5型的方法，其特征在于，所述中空纤维膜过滤系统的中空纤维柱孔径为0.1-0.2um。5.根据权利要求1到3任一项所述的一种纯化副猪嗜血杆菌血清4型和血清5型的方法，其特征在于，步骤(1)所述超滤浓缩的倍数是5-20倍体积。6.根据权利要求1到3任一项所述的一种纯化副猪嗜血杆菌血清4型和血清5型的方法，其特征在于，步骤(1)所述超滤浓缩过程中，剪切速率为小于6000sec-1。7.根据权利要求1到3任一项所述的一种纯化副猪嗜血杆菌血清4型和血清5型的方法，其特征在于，步骤(1)所述超滤浓缩过程中，跨膜压为小于20psi。8.根据权利要求1所述的一种纯化副猪嗜血杆菌血清4型和血清5型的方法，其特征在于，步骤(2)所述的缓冲液为pH值为7.2-7.4的PBS溶液。9.根据权利要求1或8所述的一种纯化副猪嗜血杆菌血清4型和血清5型的方法，其特征在于，步骤(2)所述的洗滤是动态等体积洗滤。2CN110066751A说明书1/5页一种纯化副猪嗜血杆菌血清4型和血清5型的方法技术领域[0001]本发明涉及抗原物质纯化技术领域，进一步涉及用于疫苗的副猪嗜血杆菌的纯化技术，具体涉及一种纯化副猪嗜血杆菌的方法，主要适用于副猪嗜血杆菌血清4型、5型。背景技术[0002]副猪嗜血杆菌(Haempohliusparasuis，HPS)是一种革兰氏阴性菌，主要侵害4-8周龄仔猪。由该菌引起的疾病称为副猪嗜血杆菌病，能够引起发病仔猪纤维素性胸膜炎、腹膜炎、心包炎、关节炎，甚至脑膜炎等症状，发病率达20％-30％，严重时死亡率可达50％。近几年，随着养猪业的规模化和集约化，受到猪场的环境、饲养管理等各方面条件的改变和影响，HPS已经成为影响养猪业健康发展的重要细菌病之一。HPS的血清型复杂多样，研究表明我国以血清4型和5型最为流行，其次是13型、14型和12型。[0003]使用抗生素防治副猪嗜血杆菌病曾起到一定的作用，但滥用抗生素导致的耐药性及食品安全问题使抗生素预防副猪嗜血杆菌病最终会被取缔。疫苗免疫接种被认为是防控副猪嗜血杆菌病最有效的方法，为防控中国副猪嗜血杆菌病疫情发挥了重要作用。[0004]副猪嗜血杆菌和其它革兰氏阴性菌一样，当细菌死亡或是灭活后会释放出内毒素，内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外膜上的脂多糖成分，是革兰氏阴性菌的主要抗原性及致病性成分。内毒素具有广泛的生物活性，能引起严重的炎症级联反应。同时副猪嗜血杆菌培养时所用的血清或其它蛋白注射后也会引起应激，因此去除培养基中血清等杂蛋白、降低