小鼠原代肝细胞的分离方法及其制得的小鼠原代肝细胞与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110724661A(43)申请公布日2020.01.24(21)申请号201910644544.4(22)申请日2019.07.17(71)申请人湖南农业大学地址410126湖南省长沙市芙蓉区农大路1号(72)发明人杨凌宸王爱兵屠迪刘伟吴映欣(74)专利代理机构北京劲创知识产权代理事务所(普通合伙)11589代理人王志敏(51)Int.Cl.C12N5/071(2010.01)权利要求书2页说明书9页附图4页(54)发明名称小鼠原代肝细胞的分离方法及其制得的小鼠原代肝细胞与应用(57)摘要本发明提供了一种小鼠原代肝细胞的分离方法及其制得的小鼠原代肝细胞与应用，涉及原代细胞分离技术领域。小鼠原代肝细胞的分离方法，包括如下步骤：将麻醉小鼠依次进行腹腔暴露、肝周管结扎、原位三步灌流和细胞分离得到小鼠原代肝细胞；原位三步灌流依次包括第一灌流，第二灌流和第三灌流；第一灌流，用第一灌流液去除红细胞，并对血液进行抗凝；第二灌流，用第二灌流液去除抗凝剂，并对肝组织进行初步消化；第三灌流，用第三灌流液进一步消化。该小鼠原代肝细胞的分离方法缓解了现有技术中缺乏一种分离后细胞活性高、贴壁迅速、存活细胞收率高、分离成本低并且分离过程不易污染的小鼠原代肝细胞分离方法的技术问题。CN110724661ACN110724661A权利要求书1/2页1.一种小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：将麻醉小鼠依次进行腹腔暴露、肝周管结扎、原位三步灌流和细胞分离得到小鼠原代肝细胞；所述原位三步灌流依次包括第一灌流，第二灌流和第三灌流；所述第一灌流，用第一灌流液去除红细胞，并对血液进行抗凝；所述第二灌流，用第二灌流液去除抗凝剂，并对肝组织进行初步消化；所述第三灌流，用第三灌流液进一步消化。2.按照权利要求1所述的小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，所述原位灌流的灌流血管为肝门静脉。3.按照权利要求2所述的小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，所述第三灌流，用第三灌流液对小鼠肝脏进行灌流以后，还包括用PBS对小鼠肝脏进行灌流清洗的步骤；优选地，所述PBS的温度为36-37℃；优选地，所述小鼠原代肝细胞的分离方法还包括在第二灌流以后用37℃的PBS预热小鼠肝脏的步骤；优选地，所述第三灌流液为IV型胶原酶溶液，温度为37℃，所述IV型胶原酶溶液的浓度为0.03-0.05％；优选地，所述IV型胶原酶溶液的浓度为0.048％；优选地，所述第一灌流液、第二灌流液和第三灌流液分别灌流150-200mL。4.按照权利要求1-3任一项所述的小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，所述肝周管结扎，结扎的肝周管包括：胆总管、胃十二指肠动脉、脾动脉、胃左动脉和后腔动脉；优选地，所述肝周管结扎依次结扎胆总管、胃十二指肠动脉、脾动脉、胃左动脉和后腔动脉；优选地，所述肝周管结扎包括如下步骤：(1)结剪断十二指肠韧带；(2)结扎胆总管；(3)结扎胃十二指肠动脉，追踪肝总动脉血液流经方向，直到暴露脾动脉与胃左动脉；(4)结扎并剪断脾动脉与胃左动脉，暴露腹腔动脉干；(5)将肝脏下翻，暴露背侧肝脏与膈肌，分离肝脏镰状韧带与左右三角韧带；(6)结扎胃左静脉，并在胰腺颈部双重结扎，并在结扎之间剪断胰腺(7)结扎后腔静脉；(8)上翻肝脏，分离肝门静脉周围淋巴组织，暴露肝门静脉，然后注射肝素100U。5.按照权利要求4所述的小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，所述细胞分离依次包括肝组织分离和细胞筛分离；所述肝组织分离包括如下步骤：将消化灌流后的肝脏分离至麻醉小鼠体外，浸入37℃的PBS溶液中，然后去除肝脏包膜、结缔组织和血管，再用移液器反复吹打，得到小鼠肝脏匀浆液；所述细胞筛分离包括如下步骤：将所述匀浆液依次过100目、200目和400目细胞筛，得到细胞悬液，对细胞悬液进行固液分离，得到小鼠原代肝细胞；优选地，所述固液分离方法为离心，所述离心转速为450-550g，离心时间为4-10min，首次离心后再用PBS重悬后离心，重复1-3次；2CN110724661A权利要求书2/2页优选地，所述离心转速为500g；优选地，所述离心是时间为5min。6.按照权利要求5所述的小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，所述原位灌流采用微量注射泵；优选地，所述原位灌流的灌流速度为1.2-1.5mL/min。7.按照权利要求6所述的小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，所述第一灌流，将第一灌流液灌流至肝脏开始膨胀时，刺破后腔静脉，释放第一灌流液；优选地，所述第一灌流过程中，轻拍肝脏表面。8.按照权利要求7所述的小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，所述肝周管结扎后还包括进行留置针放置，所述留置针放置包括如下步骤：将预置缝线环绕肝门静脉背