一种固定化米曲霉单宁酶及其固定化方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110964709A(43)申请公布日2020.04.07(21)申请号201911368740.X(22)申请日2019.12.26(71)申请人肇庆学院地址526061广东省肇庆市端州区肇庆大道申请人广西科技大学(72)发明人张帅程昊(74)专利代理机构北京方圆嘉禾知识产权代理有限公司11385代理人朱玲艳(51)Int.Cl.C12N11/087(2020.01)C12N11/08(2020.01)C12N9/18(2006.01)C12R1/69(2006.01)权利要求书2页说明书9页附图2页(54)发明名称一种固定化米曲霉单宁酶及其固定化方法(57)摘要本发明提供了一种固定化米曲霉单宁酶及其固定化方法，属于酶固定化领域。本发明选用的固定化载体用于固定化米曲霉单宁酶时，能够固定化米曲霉单宁酶具有优异的活力和酶活回收率。且本发明选用的固定化载体为价格低廉且性质稳定的树脂材料，投入生产中有利于降低产品成本，同时，制备的苯乙烯/丙烯酸酯基型大孔吸附树脂(ECR-1030M树脂)固定化米曲霉单宁酶活力高、保藏稳定性好、循环使用次数多，能够作为一种新型固定化酶制剂投入到工业应用。CN110964709ACN110964709A权利要求书1/2页1.一种米曲霉单宁酶的固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：将固定化载体浸于戊二醛水溶液中活化，得到活化载体，所述固定化载体为羧基型阳离子吸附树脂、环氧基型共价偶联树脂、胺基型阴离子吸附树脂、极性芳基型静电吸附树脂、非极性芳基型静电吸附树脂、二苯乙烯/丙烯酸酯基型大孔吸附树脂、十八烷基型大孔吸附树脂或环氧基型共价偶联树脂；将所述活化载体、米曲霉单宁酶和PBS缓冲液混合，进行固定化，使米曲霉单宁酶固定于活化载体中。2.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述二苯乙烯/丙烯酸酯基型大孔吸附树脂的粒径为300～700μm，孔径为25nm，比表面积＞100m2/g。3.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述活化载体和米曲霉单宁酶的料酶比为1g：10～30mL。4.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述固定化的时间为2～10h，温度为室温。5.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述固定化载体与戊二醛水溶液的用量比为1g:10～30mL，所述戊二醛水溶液的浓度为2～5％。6.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述米曲霉单宁酶的制备方法包括以下步骤：将米曲霉接种于PDA斜面培养基中进行活化培养，得到活化菌种；将所述活化菌种进行接种，得到接种剂；将所述接种剂在发酵培养基中进行发酵培养后提取，得到粗酶；将所述粗酶液进行超滤浓缩，得到米曲霉单宁酶。7.根据权利要求6所述的固定化方法，其特征在于，所述活化培养的温度为28～30℃，时间为72～90h。8.根据权利要求6所述的固定化方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为28～30℃，时间为90～108h。9.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述固定化载体使用前进行预处理，当所述固定化载体为胺基型阴离子吸附树脂时，所述预处理为：①水振荡冲洗1h；②2.5％盐酸溶液振荡冲洗2h；③水洗至pH为中性；④4％NaOH溶液振荡冲洗2h；⑤水洗至pH为中性；⑥用PBS缓冲液振荡平衡2h；⑦过滤备用；当所述固定化载体为羧基型阳离子吸附树脂时，所述预处理为：①水振荡冲洗1h；②4％NaOH溶液振荡冲洗2h；③水洗至pH为中性；④5％盐酸溶液振荡冲洗2h；⑤水洗至pH为中性；⑥用PBS缓冲液振荡平衡2h；⑦过滤备用；当所述固定化载体为极性芳基型静电吸附树脂、非极性芳基型静电吸附树脂、二苯乙烯/丙烯酸酯基型大孔吸附树脂或十八烷基型大孔吸附树脂时，所述预处理为：①乙醇振荡浸泡2h；②过滤；③丙酮振荡浸泡2h；④过滤；⑤水振荡冲洗至无有机溶剂残留；⑥过滤备用；当所述固定化载体为环氧基型共价偶联树脂或环氧基型共价偶联树脂时，所述预处理为：①水振荡冲洗2h；②用PBS缓冲液振荡平衡3次；③过滤备用。2CN110964709A权利要求书2/2页10.权利要求1～9任一项所述的固定化方法制得的固定化米曲霉单宁酶。3CN110964709A说明书1/9页一种固定化米曲霉单宁酶及其固定化方法技术领域[0001]本发明涉及酶固定化技术领域，尤其涉及一种固定化米曲霉单宁酶及其固定化方法。背景技术[0002]单宁酶(Tannase，EC3.1.1.20)是一种主要由丝状真菌产生的诱导酶，可高效水解没食子酰单宁、鞣花单宁以及没食子酸烷基酯等化合物，因而在没食子酸生产、速溶茶除沉淀、果汁脱涩、单宁废水去污等方面有着广阔的应用前景。然而，由于米曲霉单宁酶生产成本较高，且使用