一种高速逆流色谱法从牛樟芝发酵物中分离安卓奎诺尔的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112778110A(43)申请公布日2021.05.11(21)申请号202110095151.X(22)申请日2021.01.25(71)申请人浙江工业大学地址310014浙江省杭州市下城区潮王路18号申请人浙江遂昌利民药业有限公司(72)发明人陶益陈林濮发祥谢樟富金孔良(74)专利代理机构杭州之江专利事务所(普通合伙)33216代理人朱枫(51)Int.Cl.C07C45/78(2006.01)C07C45/79(2006.01)C07C49/753(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图4页(54)发明名称一种高速逆流色谱法从牛樟芝发酵物中分离安卓奎诺尔的方法(57)摘要本发明公开了一种高速逆流色谱法从牛樟芝发酵物中分离安卓奎诺尔的方法，通过正交实验筛选出牛樟芝发酵物中安卓奎诺尔的最佳提取条件和液液分离最佳溶剂体系，采用高速逆流色谱进行液液分离，同时采用液相色谱和核磁共振等技术对分离得到的安卓奎诺尔进行结构鉴定。本发明提供的分离方法具有溶质峰分离度良好、所得到的安卓奎诺尔单体收率高、纯度高等优点，实现了一步纯化制备高纯度安卓奎诺尔。CN112778110ACN112778110A权利要求书1/1页1.一种高速逆流色谱法从牛樟芝发酵物中分离安卓奎诺尔的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)取牛樟芝发酵粉末，用35‑50倍体积的乙酸乙酯溶液浸泡30min后，60‑80℃下超声提取80‑100min，然后，过滤得到澄清提取液，低温旋干，得到含安卓奎诺尔的牛樟芝粗提物；2)将高速逆流色谱两相溶剂体系置于分液漏斗中，摇匀、静置分层，平衡后，将上、下两相分离；其中所述的高速逆流色谱溶剂体系是石油醚：乙酸乙酯：甲醇：水，体积比为1‑4：0.5‑2：1‑4：0.5‑2；3)将步骤1)所得到的安卓奎诺尔粗提物用步骤2)所述的上相和下相各5mL混合溶解，制得进样样品；4)取上相作固定相，以10‑15mL/min流速填充满整个逆流色谱仪中得色谱柱，并设定恒温循环器温度为25℃；以700‑900rpm转速正转，开启逆流色谱仪主机后取下相做流动相，并以2.0mL/min流速泵入色谱柱内，待仪器达到动力学平衡时，开启固定波长254nm的检测器采集数据，基线平稳后将步骤3)得到的样品溶液经由进样阀进样；根据检测器图谱收集目标组分，合并减压浓缩干，得到安卓奎诺尔。2.根据权利要求1所述的一种高速逆流色谱法从牛樟芝发酵物中分离安卓奎诺尔的方法，其特征在于：所述的步骤4)还包括高效液相色谱检测步骤，该步骤是将所收集的目标组分先进行高效液相色谱检测，再合并特征峰位置相同、纯度较高的目标组分，减压蒸干；其中所述的高效液相色谱检测条件为：色谱柱规格：ZORBAXEclipseXDBC18(4.6mm×25mm，5μm)，柱温：28℃；流动相：乙腈和0.5％乙酸‑水；梯度洗脱；流速为1.0mL/min；紫外检测器波长：254nm。3.根据权利要求1所述的一种高速逆流色谱法从牛樟芝发酵物中分离安卓奎诺尔的方法，其特征在于：所述步骤1)中牛樟芝乙酸乙酯粗提物的制备方法为：精密称取40‑50g牛樟芝发酵粉末，置于具塞锥形瓶中，按料液比为1：35‑50加入乙酸乙酯溶液，浸泡30min后，于60‑80℃下超声提取80‑100min后过滤，重复提取2次，合并滤液，减压浓缩至干燥膏体，于4℃避光保存备用。4.根据权利要求1所述的一种高速逆流色谱法从牛樟芝发酵物中分离安卓奎诺尔的方法，其特征在于：所述的乙酸乙酯溶液是体积浓度为90‑100％乙酸乙酯。2CN112778110A说明书1/6页一种高速逆流色谱法从牛樟芝发酵物中分离安卓奎诺尔的方法技术领域[0001]本发明涉及一种高速逆流色谱法从牛樟芝生物发酵粉中分离安卓奎诺尔的方法，属于天然活性化合物分离制备技术领域。高速逆流色谱法用于分离制备目标产物，建立了一种高效的安卓奎诺尔的分离制备方法。背景技术[0002]牛樟芝(Antrodiacamphorata)是一种寄生于台湾特有树种牛樟树上的珍稀药食两用腐木真菌。其具有保护肝脏、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、调节免疫、保护神经、抗光损伤、抗菌、调节血糖及血脂等功效。牛樟芝中含有三萜、多糖为主的多种生物活性物质，其中，于2007年在牛樟芝固态发酵粉末中得到的新化合物安卓奎诺尔(Antroquinonol，AQ)[1]，对胰腺癌、肝癌具有显著抑制作用[2,3]，是具有光明前景的抗癌化合物。但AQ相关的分离制备方法研究甚少，专利ZL201410323967.3报道的AQ分离纯化方法[4]需过两次柱层析，操作繁琐，使用苯等毒性溶剂，耗时长，且制备液相柱的死体积吸附难以避免。此外，市场上没有AQ的标准品销售，若想进一