肉毒毒素的制造方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113056478A(43)申请公布日2021.06.29(21)申请号201980076236.4(74)专利代理机构北京汇思诚业知识产权代理(22)申请日2019.12.17有限公司11444代理人孙明王刚(30)优先权数据2018-2392142018.12.21JP(51)Int.Cl.C07K14/195(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日C12P21/02(2006.01)2021.05.19(86)PCT国际申请的申请数据PCT/JP2019/0494362019.12.17(87)PCT国际申请的公布数据WO2020/129986JA2020.06.25(71)申请人一般财团法人阪大微生物病研究会地址日本国大阪府吹田市山田丘3番1号(72)发明人横内大辅三浦亚希子冈田龙山下雄三佐佐木勇弥西畑省吾权利要求书2页说明书17页附图4页(54)发明名称肉毒毒素的制造方法(57)摘要本发明提供一种简便、毒素收率高、且可得到比活性高的毒素的肉毒毒素的制造方法。一种肉毒毒素的制造方法，其包含：(A)在培养基中由肉毒毒素产生菌产生肉毒毒素，得到包含源自上述肉毒毒素的菌体成分以及核酸成分和肉毒毒素的混合物a的工序；(B)将上述混合物a供于上述菌体成分的除去，得到包含核酸成分和肉毒毒素的混合物b的工序；(C)在上述混合物b中添加核酸内切酶，得到包含核酸分解物和肉毒毒素的混合物c的工序；(D)将上述混合物c供于核酸分解物的除去，得到肉毒毒素分离液d的工序。CN113056478ACN113056478A权利要求书1/2页1.一种肉毒毒素的制造方法，其特征在于，包含：(A)在培养基中由肉毒毒素产生菌产生肉毒毒素，得到包含源自所述肉毒毒素的菌体成分以及核酸成分和肉毒毒素的混合物a的工序；(B)将所述混合物a供于所述菌体成分的除去，得到包含核酸成分和肉毒毒素的混合物b的工序；(C)在所述混合物b中添加核酸内切酶，得到包含核酸分解物和肉毒毒素的混合物c的工序；(D)将所述混合物c供于核酸分解物的除去，得到肉毒毒素分离液d的工序。2.根据权利要求1所述的肉毒毒素的制造方法，其中，在所述(C)工序中，所述核酸内切酶为源自粘质沙雷氏菌Serratiamarcescens的核酸内切酶。3.根据权利要求1或2所述的肉毒毒素的制造方法，其中，在pH5.8～6.5的条件下进行所述(C)工序。4.根据权利要求1～3中任一项所述的肉毒毒素的制造方法，其中，在所述(C)工序中，多次添加所述核酸内切酶。5.根据权利要求1～4中任一项所述的肉毒毒素的制造方法，其中，在所述(D)工序中，所述核酸分解物的除去包含使用膜的除去。6.根据权利要求1～5中任一项所述的肉毒毒素的制造方法，其中，所述肉毒毒素的制造方法还包含：(E)将所述肉毒毒素分离液d供于阳离子交换色谱，得到肉毒毒素复合体的纯化物的工序。7.根据权利要求6所述的肉毒毒素的制造方法，其中，所述肉毒毒素的制造方法还包含：(F)将所述肉毒毒素复合体的纯化物，在无毒性非HA蛋白质从所述肉毒毒素复合体解离的条件下供于阴离子交换色谱，得到肉毒毒素非复合体的纯化物的工序。8.根据权利要求1～7中任一项所述的肉毒毒素的制造方法，其中，至少所述(A)工序包含预培养工序和主培养工序，至少所述预培养工序在静置培养下进行。9.根据权利要求1～8中任一项所述的肉毒毒素的制造方法，其中，在静置培养下进行所述预培养工序和所述主培养工序这两者。10.根据权利要求8或9所述的肉毒毒素的制造方法，其中，所述(A)工序依次包含：(A1)在pH6.8～8.0的培养基中进行所述肉毒毒素产生菌的菌体增殖的工序；(A2)在pH5.0～6.5的培养基中进行所述肉毒毒素产生菌的发酵的工序。11.根据权利要求1～10中任一项所述的肉毒毒素的制造方法，其中，在所述(A)工序中，所述肉毒毒素产生菌为以芽孢的形态保存的菌体的萌发体。12.根据权利要求1～11中任一项所述的肉毒毒素的制造方法，其中，在所述(B)工序中，所述菌体成分的除去包含过滤器过滤。13.根据权利要求7～12中任一项所述的肉毒毒素的制造方法，其中，在所述(F)工序2CN113056478A权利要求书2/2页中，所述条件为pH7.3～8.5。14.根据权利要求7～13中任一项所述的肉毒毒素的制造方法，其中，在所述(F)工序中，阴离子交换色谱为弱阴离子交换色谱。15.一种纯化肉毒毒素，其特征在于，所述纯化肉毒毒素的比活性为3.0×107U/mg以上。16.一种纯化肉毒毒素，其特征在于，所述纯化肉毒毒素通过权利要求1～14中任一项所述的肉毒毒素的制造方法制造。3CN113056478A说明书1/17页肉毒毒素的