同时检测血液样本中醛固酮和肾素活性的方法及试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113049697A(43)申请公布日2021.06.29(21)申请号202110260233.5(22)申请日2021.03.10(71)申请人山东英盛生物技术有限公司地址250101山东省济南市高新区大正路1777号生物医药园中小企业产业化基地12号楼405厂房(72)发明人冯振景叶松弭兆元(74)专利代理机构济南圣达知识产权代理有限公司37221代理人张晓鹏(51)Int.Cl.G01N30/02(2006.01)G01N30/06(2006.01)G01N30/72(2006.01)权利要求书2页说明书7页附图2页(54)发明名称同时检测血液样本中醛固酮和肾素活性的方法及试剂盒(57)摘要本发明公开了一种同时检测血液样本中醛固酮和肾素活性的方法及试剂盒，包括样品前处理步骤和进样检测步骤，其中，样品前处理包括如下步骤：向血液样本中加入孵育缓冲液，孵育设定时间后，加入pH值调节剂，净化后，得处理液，将处理液氮气吹干，后采用流动相复溶，得待测液；所述pH值调节剂为甲酸、氨水或乙酸铵；采用液相色谱串联质谱方法进行检测。本发明方法的优化方向一方面在于，针对血管紧张素I的物理性质，优化前处理过程，采用10～100mM的乙酸铵为pH值调节剂，降低其在待测溶液中的质子化解离，提高其在SPE处理中的回收率，大大提高了物质的检测灵敏度；另一方面，经SPE提取后，增加氮吹操作，复溶后进行上样，对检测信号的提高。CN113049697ACN113049697A权利要求书1/2页1.一种同时检测血液样本中醛固酮和肾素活性的方法，其特征在于：包括样品前处理步骤和进样检测步骤，其中，样品前处理包括如下步骤：向血液样本中加入孵育缓冲液，孵育设定时间后，加入pH值调节剂，净化后，得处理液，将处理液氮气吹干，后采用流动相复溶，得待测液；所述pH值调节剂为甲酸、氨水或乙酸铵；采用液相色谱串联质谱方法进行检测。2.根据权利要求1所述的同时检测血液样本中醛固酮和肾素活性的方法，其特征在于：所述血液样本为血浆或血清，优选为血清。3.根据权利要求1所述的同时检测血液样本中醛固酮和肾素活性的方法，其特征在于：甲酸的浓度为0.1～2％，优选为1％，％为质量百分数；氨水的浓度为0.5～8％，优选为5％，％为质量百分数；乙酸铵的浓度为10～100mM，优选为50mM；进一步的，血液样本的pH值调节剂为10～100mM的乙酸铵。4.根据权利要求1所述的同时检测血液样本中醛固酮和肾素活性的方法，其特征在于：所述孵育缓冲液为Tris‑base与EDTA的混合液，其中的pH值调节剂为冰醋酸；进一步的，所述孵育缓冲液的pH值为6.0‑6.5；在一些实施例中，孵育的时间为2.5‑3.5h，孵育的温度为36.5‑37℃。5.根据权利要求1所述的同时检测血液样本中醛固酮和肾素活性的方法，其特征在于：向血液样本中加入pH值调节剂后，采用BiotageEVOLUTEEXPRESSABN进行纯化；进一步的，将血液样本上样BiotageEVOLUTEEXPRESSABN后，分别经由纯水和10％乙腈淋洗后，采用纯甲醇洗脱，获得处理液；在一些实施例中，还包括向血液样本中加入内标溶液的步骤；进一步的，所述内标溶液为含有ALD‑D7和AngI‑13C15N，其浓度分别为1ng/mL和3ng/mL；更进一步的，血液样本、内标溶液和孵育缓冲液的体积比为8‑12:8‑12:5‑7，优选为10:10:6；进一步的，血液样本与复溶溶液的体积比为4‑6:2，优选为5:2。6.根据权利要求1所述的同时检测血液样本中醛固酮和肾素活性的方法，其特征在于：液相色谱串联质谱系统为YSEXACT9050MD、YSEXACT9900MD、岛津LCMS‑8050或AB4500MD，正离子电喷雾离子化的多离子反应监测；在一些实施例中，液相色谱的条件为：流动相A为含2‑10mM氟化铵HPLC级水；流动相B为纯甲醇；梯度洗脱；进一步的，液相色谱的色谱柱为C18脂溶性色谱柱子100mm×2.1mm，3.0μm，柱温：40℃；进一步的，梯度洗脱程序为：0‑0.5min，流动相B的体积分数为30％；0.5‑1min，流动相B的体积分数为50％；1‑3min，流动相B的体积分数为60％；3‑3.1min，流动相B的体积分数为95％；4‑4.1min，流动相B的体积分数为30％；4.1‑5min，流动相B的体积分数为30％。7.根据权利要求1所述的同时检测血液样本中醛固酮和肾素活性的方法，其特征在于：质谱条件为：采用电喷雾ESI源，喷雾电压4500V，离子传输管温度300℃，蒸发温度350℃，鞘气40arb，辅气5arb，采用MRM模式采集数据；2CN11304969