一种产β-甘露聚糖酶的菌株及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113801815A(43)申请公布日2021.12.17(21)申请号202111106429.5(51)Int.Cl.(22)申请日2021.09.22C12N1/20(2006.01)C12N9/42(2006.01)(83)生物保藏信息C12P19/14(2006.01)CGMCCNo.225752021.05.20C12P19/12(2006.01)(71)申请人河南省科学院生物研究所有限责任C12P19/04(2006.01)公司C12P19/00(2006.01)地址450003河南省郑州市花园路28号C12R1/07(2006.01)申请人河南省科学院(72)发明人王佰涛刘德海杨文玲雷高李珊珊权淑静李亮亮甄静王继雯陈国参丁芳(74)专利代理机构郑州天阳专利事务所(普通合伙)41113代理人聂孟民权利要求书2页说明书9页序列表1页附图1页(54)发明名称一种产β-甘露聚糖酶的菌株及其应用(57)摘要本发明涉及产β‑甘露聚糖酶的菌株及其应用，可有效解决产β‑甘露聚糖酶及在制备甘露寡糖中的应用问题，本发明一种产β‑甘露聚糖酶的菌株WBT0011，分类命名为沙福芽孢杆菌（Bacillussafensis），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.22575，保藏日期2021年5月20号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；该菌株WBT0011能产β‑甘露聚糖酶，可实现在制备甘露寡糖中的应用。本发明菌株有效用于产β‑甘露聚糖酶的制备，该β‑甘露聚糖酶可有效用于制备甘露寡糖，制备和应用方法简单，绿色环保，可应用于饲料、食品添加剂等领域，能有效提高营养吸收率，具有广阔的应用前景。CN113801815ACN113801815A权利要求书1/2页1.一种产β‑甘露聚糖酶的菌株WBT0011，分类命名为沙福芽孢杆菌(Bacillussafensis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.22575，保藏日期2021年5月20号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2.权利要求1所述的产β‑甘露聚糖酶的菌株WBT0011在制备β‑甘露聚糖酶中的应用，其特征在于，制备β‑甘露聚糖酶的方法包括以下步骤：(1)菌种活化：将冻存保藏菌株WBT0011，接种于活化培养基中，37℃、180r/min培养24h；所述活化培养基为：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠5g、pH7.4，加蒸馏水至1000mL，121℃灭菌25分钟，冷却备用；(2)种子培养：将上述活化菌种按照接种量1％接种于种子培养基中，37℃、180r/min培养24h；所述种子培养基为：蛋白胨10g、牛肉粉3g、氯化钠5g、pH7.3，加蒸馏水至1000mL，121℃灭菌25分钟，冷却备用；(3)发酵培养：将上述种子液按照接种量2％接种于β‑甘露聚糖酶产酶培养基中，37℃、180r/min培养48h得到发酵酶液，而后在4℃、12000r/min条件离心10min，得到上清液即为β‑甘露聚糖酶，酶活测定：在37℃、pH5.5条件下，每分钟从浓度为3mg/mL的甘露聚糖溶液中释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个β‑甘露聚糖酶活力单位(U)，计算公式为：β‑甘露聚糖酶活力式中：A表示酶液的吸光度，A0表示空白吸光度，K表示标准曲线斜率，b表示标准曲线截距，M表示D‑甘露糖的摩尔质量，30表示酶解反应时间，1000表示单位换算系数，酶活力为3.8U/mL。3.权利要求2所述制备的β‑甘露聚糖酶在制备甘露寡糖中的应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)底物的制备准确称取10g魔芋胶，加入800mL的pH5..5的乙酸‑乙酸钠缓冲液，不断搅拌并持续加热，至魔芋胶溶解完全，用pH5..5的乙酸‑乙酸钠缓冲液定容为1L，制成1％魔芋胶溶液；(2)粗酶液的制备发酵结束后，吸取发酵液在4℃、12000r/min条件下离心10min，弃去沉淀，所得上清液即为β‑甘露聚糖酶液；(3)酶解条件将酶液和魔芋胶溶液按照1:10体积比混合，在50℃水浴反应12h，得到酶解粗产物。取1mL酶解粗产物在12000r/min、4℃条件离心10min，吸取上清，弃去沉淀，吸取上清液0.5mL加入0.5mL50％乙醇溶液混匀，在12000r/min、4℃条件离心10min吸取上清，弃去沉淀，得到甘露寡糖溶液；(4)定性定量分析用还原糖转化率代表酶液的水解效率，采用DNS法酶解产物还原糖进行定量，还原糖转化率(％)＝还原糖含量(g)/魔芋胶含量(g)；甘露寡糖