利用酶自组装形成超分子水凝胶用于生物催化的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114574455A(43)申请公布日2022.06.03(21)申请号202210216094.0(22)申请日2022.03.07(71)申请人清华大学地址100084北京市海淀区清华园(72)发明人王玉军陈强骆广生(74)专利代理机构北京清亦华知识产权代理事务所(普通合伙)11201专利代理师黄德海(51)Int.Cl.C12N9/04(2006.01)C12N11/02(2006.01)C12P7/02(2006.01)权利要求书1页说明书9页附图1页(54)发明名称利用酶自组装形成超分子水凝胶用于生物催化的方法(57)摘要本发明公开了利用酶自组装形成超分子水凝胶用于生物催化的方法，包括利用酶自组装法固定乙醇脱氢酶的方法及其用途、合成R‑手性醇的方法，其中利用酶自组装法固定乙醇脱氢酶的方法包括：将乙醇脱氢酶、含氮有机配体和pH缓冲液混合，得到预凝胶化初始溶液；将初始溶液和金属离子溶液混合并继续进行凝胶化反应，得到凝胶溶液；对凝胶溶液进行离心、洗涤和冻干处理，得到含有乙醇脱氢酶的多孔水凝胶。该固定化方法步骤简单，不需要载体，无需进行化学修饰和额外的添加剂，相比于游离酶，该通过酶自组装得到的水凝胶具有更好的有机溶剂耐受性、热稳定性和储存稳定性，用于催化不对称还原芳基酮合成R‑手性醇具有很高的收率和手性选择性。CN114574455ACN114574455A权利要求书1/1页1.一种利用酶自组装法固定乙醇脱氢酶的方法，其特征在于，包括：(1)将乙醇脱氢酶、含氮有机配体和pH缓冲液混合，得到预凝胶化初始溶液；(2)将所述初始溶液和金属离子溶液混合并继续进行凝胶化反应，得到凝胶溶液；(3)对所述凝胶溶液进行离心、洗涤和冻干处理，得到含有乙醇脱氢酶的多孔水凝胶。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)满足以下条件中的至少之一：所述含氮有机配体和所述乙醇脱氢酶的质量比为(0.1～1000)：1；所述初始溶液中乙醇脱氢酶的浓度为0.01～50mg/mL；所述含氮有机配体为选自3‑甲基‑1，2，4‑三氮唑、3‑硝基‑1，2，4‑三氮唑、2‑甲基咪唑、1，2，4‑三氮唑和1‑甲基‑1，2，4‑三氮唑中的至少之一。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)满足以下条件中的至少之一：所述含氮有机配体和所述乙醇脱氢酶的质量比为(1.25～75)：1；所述含氮有机配体为3‑甲基‑1，2，4‑三氮唑；所述混合为静置或搅拌1～500min；所述初始溶液的温度为5～80℃，所述初始溶液的pH值为6～8；所述pH缓冲液包括选自MES缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液中的至少之一。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)满足以下条件中的至少之一：所述初始溶液和所述金属离子溶液的混合液中，金属离子的浓度为0.0001～100mg/mL；所述金属离子溶液中的金属离子包括选自镍离子、钴离子、镁离子、钙离子中的至少之一；所述凝胶化反应的温度为5～80℃、时间为1～20h。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述金属离子为镁离子和/或钙离子。6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述多孔水凝胶中乙醇脱氢酶的含量为30～80wt％。7.权利要求1～6中任一项所述的方法或采用权利要求1～6中任一项所述的方法制得的含有乙醇脱氢酶的多孔水凝胶在合成R‑手性醇中的用途。8.一种合成R‑手性醇的方法，其特征在于，包括：将采用权利要求1～6中任一项所述的方法制得的含有乙醇脱氢酶的多孔水凝胶、酮类反应底物、异丙醇脱氢酶和磷酸盐缓冲液混合，于10～50℃下进行反应，以便得到R‑手性醇。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，原料混合液中，酮类反应底物的浓度为1～50mmol/L，所述异丙醇脱氢酶的浓度为0.01～10mmol/L，所述多孔水凝胶中乙醇脱氢酶的总质量与酮类反应底物的摩尔数的比值为(0.2～1)mg：(1～20)mmol。10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述酮类反应底物为芳基酮，任选地，所述芳基酮包括选自苯乙酮、4‑氟苯基丙酮、4‑苯基‑2‑丁酮、苯氟乙酮和2‑氧代‑4‑苯基丁酸乙酯中的至少之一。2CN114574455A说明书1/9页利用酶自组装形成超分子水凝胶用于生物催化的方法技术领域[0001]本发明属于生物催化技术领域，涉及利用酶自组装形成超分子水凝胶用于生物催化的方法，具体而言包括利用酶自组装法固定乙醇脱氢酶的方法及其用途、合成R‑手性醇的方法。背景技术[0002]生物催化具有高选择性、高效、绿色温和的特点，是人类物质生产进步的强大推动力。其中，生物催化剂是核心。酶作为广泛应用的生物催化剂，其分离纯化和重复使用是制约工业应用