一种离子液体强化赖氨酸脱羧酶合成1,5-戊二胺的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114621984A(43)申请公布日2022.06.14(21)申请号202011474131.5(22)申请日2020.12.14(71)申请人中国科学院过程工程研究所地址100190北京市海淀区中关村北二条1号(72)发明人黄玉红姚稼灏薛雅鞠张锁江(74)专利代理机构北京品源专利代理有限公司11332专利代理师巩克栋(51)Int.Cl.C12P13/00(2006.01)C12N9/88(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12N1/21(2006.01)C12R1/19(2006.01)权利要求书2页说明书9页(54)发明名称一种离子液体强化赖氨酸脱羧酶合成1,5-戊二胺的方法(57)摘要本发明涉及一种离子液体强化赖氨酸脱羧酶合成1,5‑戊二胺的方法，属于生物化工领域。所述的离子液体强化赖氨酸脱羧酶合成1,5‑戊二胺的方法中，将离子液体、底物赖氨酸、辅酶磷酸吡哆醛、纯化的赖氨酸脱羧酶或者含有赖氨酸脱羧酶的基因工程菌细胞悬液和缓冲液进行混合，通过一步催化反应即可得到目标产物1,5‑戊二胺，所述离子液体包括胆碱类离子液体与咪唑类离子液体，能够显著提高赖氨酸脱羧酶的活性，提升赖氨酸脱羧酶的催化效率。所述方法的工艺步骤十分简单，能够快速、高效地获得高收率的1,5‑戊二胺，有利于戊二胺合成的工程化放大。CN114621984ACN114621984A权利要求书1/2页1.一种离子液体强化赖氨酸脱羧酶合成1,5‑戊二胺的方法，所述方法包括：将离子液体、底物赖氨酸、磷酸吡哆醛、纯化的赖氨酸脱羧酶或者含有赖氨酸脱羧酶的基因工程菌细胞悬液和缓冲液混合，得到的混合液进行催化反应，生成所述1,5‑戊二胺。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离子液体任意一种或至少两种的组合；优选地，所述离子液体包括胆碱类和咪唑类任意一种或至少两种的组合；优选地，所述胆碱类离子液体包括胆碱甘氨酸、胆碱丙氨酸、胆碱缬氨酸、胆碱亮氨酸、胆碱异亮氨酸、胆碱苯丙氨酸、胆碱脯氨酸、胆碱赖氨酸、胆碱精氨酸、胆碱组氨酸、胆碱色氨酸、胆碱丝氨酸、胆碱油酸、胆碱磷酸二氢盐、胆碱酪氨酸、胆碱半胱氨酸、胆碱谷氨酸、胆碱氯。优选地，所述咪唑类离子液体包括1‑羧甲基‑3‑甲基咪唑氯盐、1‑十二烷基‑3‑甲基咪唑氯盐、1‑烯丙基‑3‑甲基咪唑氯盐、1‑乙基‑3‑甲基咪唑溴盐、1‑丁基‑3‑甲基咪唑溴盐、1‑己基‑3‑甲基咪唑溴盐、1‑十二烷基‑3‑甲基咪唑溴盐、1‑乙基‑3‑甲基咪唑双(三氟甲磺酰)亚胺、1‑丁基‑3‑甲基咪唑双(三氟甲磺酰)亚胺、1‑丁基‑3‑甲基咪唑三氟甲磺酸盐、1‑乙基‑3‑甲基咪唑醋酸盐、1‑丁基‑3‑甲基咪唑醋酸盐、1‑乙基‑3‑甲基咪唑双氰胺盐。优选地，所述离子液体为胆碱类离子液体。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述混合液中离子液体的质量体积百分浓度为0.0001～50％，优选为0.001～10％；优选地，所述离子液体为胆碱半胱氨酸离子液体和胆碱谷氨酸离子液体。4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述底物赖氨酸包括L‑赖氨酸盐酸盐；优选地，所述混合液中底物赖氨酸的浓度为1～3mol/L；优选地，所述混合液中磷酸吡哆醛的浓度为0.001～0.5mM；优选地，所述混合液的纯的赖氨酸脱羧酶的浓度为0～3000μg/mL；优选地，所述混合液的OD600为0.5～30。5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述赖氨酸脱羧酶为将赖氨酸转化为1,5‑戊二胺的酶；优选地，所述赖氨酸脱羧酶包括来源于微生物的赖氨酸脱羧酶及其突变体；优选地，所述微生物包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、蜂房哈夫尼菌、耐碱芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、尸杆菌、伯克霍尔德氏菌、青紫色素杆菌、霍乱弧菌、毛链霉菌、反刍动物月形单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、邦戈沙门氏菌、沙雷氏菌属、迟缓爱德华氏菌、博代氏杆菌属、气单胞菌属或克雷伯氏菌属中的任意一种或至少两种的组合。6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌细胞悬液的制备方法为：将基因工程菌株置于含有氨苄抗生素的LB培养基中培养，获得种子液；将所述种子液接种于含有氨苄抗生素的LB培养基中发酵培养，至OD600为0.6～1时加入诱导剂进行诱导培养，然后离心收集菌体，将菌体重悬，得到所述基因工程菌细胞悬液；优选地，所述种子液的接种量为0.5～5％；优选地，所述诱导剂包括异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷；优选地，所述诱导培养的时间为5～30h；2CN114621984A权利要求书2/2页优选地，所述诱导培养的温度为15～25℃。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌株的构建方法包括：将携带有赖氨酸脱羧酶L