一种重组抗EGFR单克隆抗体的纯化方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115947847A(43)申请公布日2023.04.11(21)申请号202211166985.6C07K1/22(2006.01)(22)申请日2022.09.23C07K1/14(2006.01)(71)申请人景泽生物医药（合肥）股份有限公司地址230000安徽省合肥市高新区创新大道2800号创新产业园二期J1栋A座13层A11-1申请人上海景泽生物技术有限公司成都景泽生物制药有限公司(72)发明人彭红卫唐德芳郭红李婷玉(74)专利代理机构成都高远知识产权代理事务所(普通合伙)51222专利代理师魏静全学荣(51)Int.Cl.C07K16/28(2006.01)C07K1/18(2006.01)权利要求书2页说明书15页序列表（电子公布）附图6页(54)发明名称一种重组抗EGFR单克隆抗体的纯化方法(57)摘要本发明提供了一种重组抗EGFR单克隆抗体的纯化方法，属于医药领域。所述纯化方法包括以下步骤：(1)将表达重组抗EGFR单克隆抗体的细胞发酵培养，收集发酵液，过滤或离心，收集清液；(2)亲和层析；(3)低pH孵育；(4)阳离子交换层析；(5)阴离子交换层析；(6)超滤，除病毒，加入辅料，除菌，得到重组抗EGFR单克隆抗体原液。本发明的纯化方法能够有效去除重组抗EGFR单克隆抗体中生物活性低的酸性组分，使重组抗EGFR单克隆抗体中的HPLC‑CEX酸性峰含量小于6％且能保证蛋白收率在87.9％以上，解决了现有技术中酸峰去除效果差的问题。本发明的纯化方法成本低，高效，稳定，能够得到高纯度重组抗EGFR单克隆抗体，非常适合工业化生产。CN115947847ACN115947847A权利要求书1/2页1.一种重组抗EGFR单克隆抗体的纯化方法，其特征在于：所述纯化方法包括以下步骤：(1)将表达重组抗EGFR单克隆抗体的细胞发酵培养，收集发酵液，过滤或离心，收集清液；(2)将步骤(1)所得滤液进行亲和层析，收集洗脱液；(3)将步骤(2)所得洗脱液进行低pH孵育，过滤，收集滤液；(4)将步骤(3)所得滤液进行阳离子交换层析，收集洗脱液；所述阳离子交换层析采用的洗脱液为由A相和B相组成的梯度洗脱液，其中B相的体积分数为5％‑65％；A相为含10‑40mM磷酸盐的溶液，pH值为5.5‑6.2；B相为含10‑40mM磷酸盐和0.05‑0.2M氯化钠的溶液，pH值为5.5‑6.2。2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤(1)中，所述细胞为CHO细胞；和/或，所述过滤为深层过滤。3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤(2)中，所述亲和层析中，填料为ProteinA、MabSelect、Prosep、POROS或TOSOH，所述ProteinA优选为AF‑rProteinA，更优选为AF‑rProteinAHc‑650F；所述亲和层析包括以下步骤：(2.1)淋洗：依次用淋洗液1和淋洗液2淋洗亲和层析柱，淋洗液1为含0.05‑0.2M柠檬酸和0.25‑1.0M氯化钠的溶液，pH为5.5‑6.2；淋洗液2为0.02‑0.10M醋酸钠溶液，pH为5.5‑6.2；优选地，淋洗液1为含0.1M柠檬酸和0.5M氯化钠的溶液，pH为6.0；淋洗液2为0.05M醋酸钠溶液，pH为6.0；(2.2)洗脱：用洗脱液进行洗脱，洗脱液为含0.05‑0.2M甘氨酸和0.01‑0.04M氯化钠的溶液，pH为2.8‑3.2；优选地，洗脱液为含0.1M甘氨酸和0.02M氯化钠的溶液，pH为3.0±0.1；(2.3)收集：收集洗脱液。4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤(3)中，所述低pH孵育的温度为20‑25℃，时间为1.5h以上，pH值为3.2‑3.6。5.根据权利要求1‑4任一项所述的纯化方法，其特征在于：步骤(4)中，所述阳离子交换层析包括以下步骤：(4.1)前平衡：用平衡液冲洗阳离子交换层析柱；所述平衡液为含10‑40mM磷酸盐的溶液，pH值为5.5‑6.2；(4.2)上样：将步骤(3)所得滤液的pH调节至5.5‑6.2，上样；(4.3)后平衡：用平衡液冲洗阳离子交换层析柱；(4.4)淋洗：用淋洗液淋洗阳离子交换层析柱；淋洗液由A相和B相组成，其中B相的体积分数为4％‑6％；(4.5)洗脱：用洗脱液进行梯度洗脱；(4.6)收集：收集洗脱液，在UV280值升至0.1AU时开始收集，在UV280值降至0.1AU时结束收集。6.根据权利要求5所述的纯化方法，其特征在于：所述阳离子交换层析中，填料为NuviaHR‑S、EshmunoCPX、POROSXS或CaptoSPImpRes，优选为NuviaHR‑S；2CN115947847A权利要求书2/2页所述平衡液为含20