一种工程菌及其构建方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115772490A(43)申请公布日2023.03.10(21)申请号202211562796.0C12R1/01(2006.01)(22)申请日2022.12.07(71)申请人清华大学地址100084北京市海淀区清华园1号申请人国家粮食和物资储备局科学研究院(72)发明人李春庞建王超郭超(74)专利代理机构北京同立钧成知识产权代理有限公司11205专利代理师杨丽刘芳(51)Int.Cl.C12N1/21(2006.01)C12N15/54(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12N15/74(2006.01)C12R1/19(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表（电子公布）附图4页(54)发明名称一种工程菌及其构建方法和应用(57)摘要本发明提供一种工程菌及其构建方法和应用。本发明第一方面提供一种工程菌，所述工程菌为过表达甲基化酶的大肠杆菌，所述甲基化酶用于对外源基因进行甲基化修饰；所述甲基化酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.3所示。本发明提供的工程菌能够对外源基因进行甲基化修饰，提高外源基因在须糖多孢菌内的转化效率，为须糖多孢菌的基因工程改造提供重要基础。CN115772490ACN115772490A权利要求书1/1页1.一种工程菌，其特征在于，所述工程菌为能够过表达甲基化酶的大肠杆菌，所述甲基化酶用于对外源基因进行甲基化修饰；所述甲基化酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.3所示。2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述甲基化酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1或2所述的工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为ET12567。4.权利要求1‑3任一项所述工程菌的构建方法，其特征在于，包括：将编码所述甲基化酶的基因整合到大肠杆菌的基因组上，实现所述甲基化酶的过表达，得到所述工程菌；所述甲基化酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.3所示。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将编码所述甲基化酶的基因、启动子J23119和核糖体结合位点B0034连接，构建得到甲基化酶的表达盒，并将所述表达盒转入大肠杆菌，筛选阳性转化子，得到所述工程菌。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，编码所述甲基化酶的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.4所示。7.权利要求1‑3任一项所述的工程菌在对外源基因进行甲基化修饰并提高所述外源基因在须糖多孢菌转化效率中的应用。8.一种提高外源基因在须糖多孢菌中转化效率的方法，其特征在于，包括：将外源基因导入权利要求1‑3任一项所述的工程菌中进行甲基化修饰，得到甲基化修饰的外源基因；将所述甲基化修饰的外源基因导入所述须糖多孢菌中。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将外源基因导入权利要求1‑3任一项所述的工程菌中进行预甲基化，得到甲基化修饰的外源基因，具体包括如下步骤：构建包括所述外源基因的重组载体，将所述重组载体导入所述工程菌中，进行甲基化修饰；提取所述工程菌的DNA，得到甲基化修饰的重组载体。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，采用原生质体转化的方法，将所述甲基化修饰的重组载体导入所述须糖多孢菌中。2CN115772490A说明书1/7页一种工程菌及其构建方法和应用技术领域[0001]本发明涉及一种工程菌及其构建方法和应用，涉及基因工程技术领域。背景技术[0002]外源DNA转化技术是基因工程和DNA克隆技术发展的基础和核心，是现代分子生物学中最重要的操作手段之一。常见的转化方法包括化学转化和电击转化，对于实验室标准菌株一般具备相对较高的转化效率，但是对于某些环境中筛选的菌株或者工业菌株，外源DNA的转化效率一般较低。[0003]例如，丁烯基多杀菌素(butenyl‑spinosyns)是一种新型大环内酯类天然产物，具有高效生物杀虫活性，是理想的绿色生物杀虫剂。常见的生产方法是利用土壤放线菌须糖多孢菌(Saccharopolysporapogona)的次级代谢产生，但是，野生型须糖多孢菌合成丁烯基多杀菌素的能力较弱、产量较低，需要利用基因工程技术改造须糖多孢菌以获得高产丁烯基多杀菌素的工程化菌株。但是，须糖多孢菌具有很强的限制性修饰系统，当外源基因进入细胞后会被快速降解，导致须糖多孢菌的遗传操作非常困难，限制了高产丁烯基多杀菌素工程菌株的构建。[0004]限制性修饰系统通常包括限制酶和修饰酶，限制酶是一种核酸内切酶，能够对外源DNA进行切割，修饰酶能够对自身DNA进行甲基化修饰。为了克服须糖多孢菌自身的限制性修饰系统，可以通过对外源基因进行甲基化修饰，使得修饰后的外源基因不被须糖多孢菌自身的限制性修饰系统