激酶基因在调控丝状真菌菌丝形态中的应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115820746A(43)申请公布日2023.03.21(21)申请号202211388724.9(22)申请日2022.11.08(71)申请人华南理工大学地址510640广东省广州市天河区五山路381号(72)发明人潘力喻乐意王斌(74)专利代理机构广州市华学知识产权代理有限公司44245专利代理师陆国宇(51)Int.Cl.C12N15/87(2006.01)C12N15/54(2006.01)C12N1/15(2006.01)C12R1/685(2006.01)权利要求书2页说明书10页序列表（电子公布）附图5页(54)发明名称激酶基因在调控丝状真菌菌丝形态中的应用(57)摘要本发明公开了激酶基因在调控丝状真菌菌丝形态中的应用。本发明首次在丝状真菌中构建RNP基因编辑体系，构建的RNP体系可以编辑黑曲霉的基因，该方法免去构建重组载体的繁琐程序，操作简单，可以用于黑曲霉的基因编辑。结合RNP体系进行基因编辑发现，敲除MpkA基因时，黑曲霉菌落较小，生长缓慢，菌丝呈现短杆状，基本无分支。同时，黑曲霉MpkA基因被敲除时，可以促进其蛋白的分泌量。本发明在丝状真菌的遗传操作以及高通量技术的应用提供了良好的材料以及理论依据，为丝状真菌在工业酶制剂领域的发展提供了研究思路。CN115820746ACN115820746A权利要求书1/2页1.激酶基因在调控丝状真菌菌丝形态中的应用，其特征在于：所述的激酶基因为丝状真菌MAPK途径和/或cAMP‑PKA途径上的激酶基因。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的激酶基因为基因Bck1、Mkk2、MpkA、SteC、PkaC中的至少一种。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的基因Bck1的核苷酸序列的FungiDB数据库序列登记号为An02g06830，基因Mkk2的核苷酸序列的FungiDB数据库序列登记号为An18g03740，基因MpkA的核苷酸序列的NCBI数据库序列登记号为XM025594238.1，基因SteC的核苷酸序列的NCBI数据库序列登记号为XM025594636.1基因MpkA的核苷酸序列的NCBI数据库序列登记号为XM025603413.1。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的基因Bck1编码的蛋白质的氨基酸序列的FungiDB数据库序列登记号为An02g06830，基因Mkk2编码的蛋白质的氨基酸序列的FungiDB数据库序列登记号为An18g03740，基因MpkA编码的蛋白质的氨基酸序列的FungiDB数据库序列登记号为An01g09520，基因SteC编码的蛋白质的氨基酸序列的FungiDB数据库序列登记号为An17g01280，基因PkaC编码的蛋白质的氨基酸序列的FungiDB数据库序列登记号为An02g04270。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的丝状真菌为黑曲霉，米曲霉，土曲霉，构巢曲霉，烟曲霉中的至少一种。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的激酶基因被敲除或沉默后，丝状真菌的菌丝结构呈短杆状，分支少，极化生长周期短，不产分生孢子等表型出现，且分泌总蛋白的能力变强；所述的敲除或沉默为使用包括CRISPR、siRNA、碱基突变等技术对激酶基因的核苷酸序列进行敲除或编辑/突变/沉默，使激酶基因不表达。7.权利要求1～6任一所述的应用，其特征在于具体包括如下步骤：(1)制备丝状真菌的原生质体；(2)敲除或沉默激酶基因；(3)在筛选平板上筛选，得到菌丝形态改变的丝状真菌。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的敲除或沉默为使用RNP基因编辑体系，具体步骤如下：(a)根据需要敲除或沉默的激酶基因设计sgRNA和修复片段；(b)将sgRNA与Cas9酶组装，孵育得到RNP基因编辑体系；(c)在丝状真菌原生质体中加入sgRNA和修复片段，孵育，实现激酶基因的敲除或沉默。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的sgRNA，是将启动子、spacerRNA与sgRNA骨架按顺序组装得到的；所述的启动子为T7或U6启动子中的至少一种；当需要敲除的为基因MpkA时，所述的spacerRNA为其核苷酸序列中正向的第12个到第31个的序列；当需要敲除的为基因SteC时，所述的spacerRNA为其核苷酸序列中正向的第28个到第47个的序列；2CN115820746A权利要求书2/2页当需要敲除的为基因PkaC时，所述的spacerRNA为其核苷酸序列中正向的第262个到第281个的序列；所述的修复片段，是将spacerRNA位点的前39bp上游同源序列、筛选标签和spacerRNA位点的后39bp下游同源序列按顺序组装得到的；所述的筛选标签为