一种重组氧化葡萄糖酸杆菌的构建及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115820643A(43)申请公布日2023.03.21(21)申请号202211411638.5C12N9/14(2006.01)(22)申请日2022.11.11C12P7/42(2006.01)C12R1/01(2006.01)(71)申请人江南大学地址214122江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号(72)发明人张显饶志明刘菲陈妍杨套伟徐美娟(74)专利代理机构哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司23211专利代理师赵巧娜(51)Int.Cl.C12N15/113(2010.01)C12N15/55(2006.01)C12N15/74(2006.01)C12N1/21(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表（电子公布）附图2页(54)发明名称一种重组氧化葡萄糖酸杆菌的构建及其应用(57)摘要本发明公开了一种重组氧化葡萄糖酸杆菌的构建及其应用，属于基因工程和全细胞催化领域。本发明通过在氧化葡萄糖酸杆菌中异源表达来源于鞘氨醇单胞菌的环氧化物水解酶，同时利用氧化葡萄糖酸杆菌自身膜结合的醇、醛脱氢酶，以环氧苯乙烷为底物一步法合成R‑扁桃酸。本发明结合氧化葡萄糖酸杆菌的转录组数据，以绿色荧光蛋白为报告基因筛选到7个强启动子，并确定出对于表达环氧化物水解酶基因最强的启动子P12780，最终显著提高了R‑扁桃酸的产量。CN115820643ACN115820643A权利要求书1/1页1.一种提高环氧化物水解酶表达量的启动子，其特征在于，所述启动子为P02805、P09400、P04650、P12780、P04000、P04750或P10190；所述启动子P02805、P09400、P04650、P12780、P04000、P04750、P10190的核苷酸序列分别如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8所示。2.一种合成R‑扁桃酸的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌以氧化葡萄糖酸杆菌621H为宿主细胞，采用权利要求1所述的启动子过表达了鞘氨醇单胞菌来源的环氧化物水解酶。3.根据权利要求2所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，其特征在于，所述启动子为P12780。4.根据权利要求3所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，其特征在于，编码所述环氧化物水解酶的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。5.根据权利要求2～4任一所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌是以pBBR1MCS‑2质粒为表达载体。6.一种制备环氧化物水解酶的方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求2～5任一所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，接种至培养基中进行发酵，制备得到环氧化物水解酶。7.一种合成R‑扁桃酸的方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求2～5任一所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌添加至含有环氧苯乙烷的反应体系中进行反应，制备得到R‑扁桃酸。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述反应体系中，氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的添加量为：细胞浓度OD600为20～30；所述环氧苯乙烷的添加量为16～20g/L。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，反应条件为：25～30℃，180～220rpm，转化28～40小时。10.权利要求2～5任一所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌在制备环氧化物水解酶，或在制备R‑扁桃酸及含有R‑扁桃酸的产品中的应用。2CN115820643A说明书1/7页一种重组氧化葡萄糖酸杆菌的构建及其应用技术领域[0001]本发明涉及一种重组氧化葡萄糖酸杆菌的构建及其应用，属于基因工程和全细胞催化技术领域。背景技术[0002](R)‑扁桃酸(Mandelicacid)，简称R‑MA，是制备许多手性药物的重要中间体，包括抗肿瘤、抗肥胖剂、头孢菌素和半合成青霉素等抗生素，在化学和制药工业中至关重要。目前，R‑MA主要通过化学法合成，而化学合成条件苛刻且副产物多，环境污染严重。相反，生物合成法则具有反应条件温和，立体选择性高、对环境友好等优点，是生产R‑MA的一种极具潜力的替代方法。然而，R‑MA的生物生产仍面临许多挑战，包括缺乏合适的催化剂和宿主菌株进行有效的合成反应。[0003]高价值天然和非天然化合物的生物制造的关键是从廉价且易于获得的底物开发绿色、高效和有前景的合成路线。环氧化物主要来自于易于获得的石油基副产品，在制备药物和精细化学品中有广泛的应用。使用廉价的环氧苯乙烷为底物生产R‑MA应用潜力巨大。环氧苯乙烷可通过环氧化物水解酶水解为R‑1‑苯基‑1，2‑乙二醇(R‑PEG)，之后被进一步氧化脱氢生成R‑MA。