一种根癌农杆菌介导的欧洲越橘转基因体系的建立方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115873897A(43)申请公布日2023.03.31(21)申请号202211207981.8(22)申请日2022.09.30(71)申请人浙江农林大学地址311300浙江省杭州市临安区锦城街道浙江农林大学东湖校区(72)发明人崔富强宋艳平(51)Int.Cl.C12N15/84(2006.01)C12N15/29(2006.01)A01H5/00(2018.01)A01H6/36(2018.01)C12N5/00(2006.01)C12N5/04(2006.01)A01H4/00(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表（电子公布）附图2页(54)发明名称一种根癌农杆菌介导的欧洲越橘转基因体系的建立方法(57)摘要本发明公开了一种根癌农杆菌介导的欧洲越橘转基因体系的建立方法，该方法包括：取欧洲越橘茎叶作为外植体，诱导其长出一层薄薄的愈伤组织；将该带有一层薄薄愈伤组织的外植体材料放入加有生长素IBA、细胞分裂素ZT和乙酰丁香酮的农杆菌侵染液中进行侵染培养，侵染培养过程中对材料进行超声破碎和真空渗透等处理，促进农杆菌质粒进入植物材料；然后将侵染后的外植体材料进行共培养后再将转基因材料移至筛选培养基中进行筛选，最终获得表现出报告基因(甜菜素合成基因)所呈现的洋红色(玫红色)欧洲越橘愈伤组织。本发明采用特定的愈伤诱导培养基、农杆菌侵染处理、共培养培养基、共培养时间、抗性愈伤组织筛选培养基等进行根癌农杆菌介导的欧洲越橘愈伤组织转基因体系的构建，得到了转基因成功的玫红色愈伤组织，并CN115873897A且转化率也提高至4％。CN115873897A权利要求书1/1页1.一种根癌农杆菌介导的欧洲越橘转基因体系的建立方法，其特征在于，包括：(1)以在无菌培养基上生长良好的欧洲越橘苗的幼嫩叶片为外植体材料，将该外植体材料切成合适大小，接种至诱导愈伤的培养基中培养，得到有愈伤的外植体；所用培养基配方为：WPM+3％蔗糖+1％琼脂+0.50mg/LIBA+2.0mg/LZT,pH＝5.2±0.02；(2)材料在再生培养基中生长10‑14d后将其作为侵染材料，然后将其放入准备好的农杆菌侵染液中进行侵染培养；(3)待侵染培养结束后，倒出侵染液，将侵染完成的材料在滤纸上晾干，放入共培养培养基中，进行共培养；所述共培养培养基为：WPM+3％蔗糖+0.85％琼脂+0.70mg/LIBA+2.0mg/LZT+20mg/LAS,pH＝5.2±0.02；(4)共培养结束后，用无菌RO水清洗转基因材料，晾干后将其放入筛选培养基中进行筛选培养，直至转基因材料愈伤组织越长越大,并表现出报告基因(甜菜素合成基因)所呈现的洋红色(玫红色)；所述筛选培养基为：WPM+3％蔗糖+0.85％琼脂+0.70mg/LIBA+2.0mg/LZT+5mg/LHYG+400mg/LCarb,pH＝5.2±0.02。2.如权利要求1所述的欧洲越橘转基因体系的建立方法，其特征在于，步骤(1)中，幼嫩枝条切为0.8cm左右的小段，叶片除去边缘部分切为0.5cm左右的方形；外植体接种方式为：叶片平铺在培养基表面，正面朝下；愈伤组织诱导培养的条件为：每天28℃条件下黑暗培养16h。3.如权利要求1所述的欧洲越橘转基因体系的建立方法，其特征在于，步骤(2)中，农杆菌种类为：陈其军实验室开发的三元体系中使用的LBA4404.这里写为LBA4404‑ternary。4.如权利要求1所述的欧洲越橘转基因体系的建立方法，其特征在于，步骤(2)中，侵染液为：加入1.4mg/LIBA、4mg/LZT、10mg/LAS的WPM溶液。5.如权利要求1所述的欧洲越橘转基因体系的建立方法，其特征在于，步骤(2)中，侵染条件为：28℃摇床先摇20‑30min,再对材料进行超声破碎(振幅60％)1min和真空渗透3次，每次5min，之后再28℃摇床摇2h。6.如权利要求1所述的欧洲越橘转基因体系的建立方法，其特征在于，步骤(3)中，共培养条件为：28℃黑暗条件下培养8d。7.如权利要求1所述的欧洲越橘转基因体系的建立方法，其特征在于，步骤(4)中，共培养结束后，用含400mg/L羧苄的灭菌RO水清洗转基因材料，清洗10遍左右，每遍30‑60s；所述筛选培养条件为：28℃黑暗条件培养，每两周继代一次，继代两次后将材料移至28℃光照条件下培养，每天光照16h，黑暗8h，光照强度为50μEm‑2s‑1，愈伤组织慢慢的有明显增殖长大，培养40‑60d后出现洋红色愈伤组织。2CN115873897A说明书1/5页一种根癌农杆菌介导的欧洲越橘转基因体系的建立方法技术领域[0001]本发明涉及林木转基因技术领域，尤其涉及一种根癌农杆菌介导的欧洲越橘转基因体系