一种产酸型槐糖脂的重组熊蜂生假丝酵母.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115896157A(43)申请公布日2023.04.04(21)申请号202210936448.9C12N15/53(2006.01)(22)申请日2022.08.05C12N15/31(2006.01)C12N1/19(2006.01)(71)申请人江南大学C12P7/6409(2022.01)地址214122江苏省无锡市滨湖区蠡湖大C12P19/44(2006.01)道1800号C12R1/72(2006.01)(72)发明人陈献忠夏媛媛杨海泉石依博张疆睿沈微(74)专利代理机构哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司23211专利代理师仇钰莹(51)Int.Cl.C12N15/81(2006.01)C12N15/65(2006.01)C12N15/90(2006.01)C12N15/55(2006.01)权利要求书1页说明书3页序列表（电子公布）附图2页(54)发明名称一种产酸型槐糖脂的重组熊蜂生假丝酵母(57)摘要本发明公开了一种产酸型槐糖脂的重组熊蜂生假丝酵母，属于代谢工程领域。所述方法包括：槐糖脂代谢途径改造；启动子工程条件关键酶的表达强度；高产酸型槐糖脂的重组熊蜂生假丝酵母的构建；菌株的发酵；酸型槐糖脂的提取分离与鉴定。本发明构建得到的重组熊蜂生假丝酵母发酵油酸能够合成单一的酸型槐糖脂，而不再合成内酯型槐糖脂，同时酸型槐糖脂的产量由20g·L‑1提高到44g·L‑1。该菌株经5L发酵罐发酵，酸型槐糖脂产量可达99.5g·L‑1。CN115896157ACN115896157A权利要求书1/1页1.一种构建重组熊蜂生假丝酵母的方法，其特征在于，敲除熊蜂生假丝酵母基因组中合成内酯型槐糖脂的关键基因—内酯酶基因SBLE。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，敲除过氧化物酶体膜转运蛋白编码基因PXA1。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在PXA1位点整合表达了CYP52M1。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在PXA1位点整合表达了CPR。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在PXA1位点整合表达了潮霉素抗性基因hph。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述熊蜂生假丝酵母为熊蜂生假丝酵母ATCC22214。7.权利要求1～6任一所述方法制备得到的重组熊蜂生假丝酵母。8.一种生产油酸的方法，其特征在于，利用权利要求7所述重组熊蜂生假丝酵母发酵生产油酸。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将所述重组熊蜂生假丝酵母经50mLYPD培养基培养过夜，以5％的接种量转接至含有发酵培养基的5L发酵罐中培养。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在发酵罐中培养24h时加入油酸继续发酵。2CN115896157A说明书1/3页一种产酸型槐糖脂的重组熊蜂生假丝酵母技术领域[0001]本发明涉及一种产酸型槐糖脂的重组熊蜂生假丝酵母，属于代谢工程领域。背景技术[0002]槐糖脂是一类由两个葡萄糖基和一个脂肪酸链组成的两亲性化合物，因其具有良好的起泡性、溶解性，乳化性及抑菌性等特性而被广泛应用。假丝酵母菌可以利用糖和植物油等为碳源，经一定条件的发酵工艺合成槐糖脂，生产过程绿色，对环境友好。熊蜂生假丝酵母(Starmerellabombicola)作为单倍体非常规酵母，是目前槐糖脂高产菌株之一，其野生型菌株主要以脂肪酸和葡萄糖作为底物，代谢合成槐糖脂。然而，野生型菌株生产的槐糖脂为酸型及内酯型混合物，两种槐糖脂拥有不同的结构、生物活性、理化性质及应用领域，如在抑菌及抗癌方面，内酯型槐糖脂具有更好的功效，而酸型槐糖脂则在精子固定和抗病毒方面具有显著的优势。当前想要获得单一组分的槐糖脂用于特定领域比较困难，因此，通过基因遗传操作，对现有野生菌株进行改造从而有目的地提高某一种特异性槐糖脂的产量将显得尤为重要。[0003]以葡萄糖和植物油为底物发酵生产酸型槐糖脂时，其合成代谢主要过程为：脂肪酸在细胞色素氧化酶CYP52M1的催化下进行ω‑氧化产生ω或ω‑1羟基脂肪酸，接着在葡萄糖基转移酶UGTA1的催化下，将UDP‑葡萄糖转移至羟基脂肪酸的羟基位置形成葡萄糖酯；再在葡萄糖基转移酶UGTB1的催化下，添加另一个葡萄糖基形成酸型槐糖脂(非乙酰化)。该酸型槐糖脂可进一步在酰基化酶AT的作用下形成，单乙酰或双乙酰酸型槐糖脂，再在multidrugresistanceprotein蛋白作用下转移至胞外，最后经内酯化酶SBLE催化，形成含有不同取代基的内酯型槐糖脂(图1)。目前微生物生产槐糖脂还存在一些问题，第一点，野生型菌株的产物为酸型及内酯型混合物，且发酵批次的不同可能导致产品中酸型及内酯型的比例也有很大差异，纯度难以保证，这也限制了其应用范围；第二点，槐糖