生产纳豆激酶的重组基因工程菌及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115948309A(43)申请公布日2023.04.11(21)申请号202211092480.XC12N15/57(2006.01)(22)申请日2022.03.30C12N15/75(2006.01)C12N15/67(2006.01)(62)分案原申请数据C12N9/54(2006.01)202210326831.22022.03.30C12R1/125(2006.01)(83)生物保藏信息CGMCCNo.195412020.03.30(71)申请人威海迪普森生物科技有限公司地址264309山东省威海市荣成市石岛牧云西路(72)发明人牟海津辜自强宁晨田明(74)专利代理机构北京科家知识产权代理事务所(普通合伙)11427专利代理师杜娇(51)Int.Cl.权利要求书1页说明书6页C12N1/21(2006.01)序列表（电子公布）附图6页(54)发明名称生产纳豆激酶的重组基因工程菌及其应用(57)摘要本发明涉及一种生产纳豆激酶的重组基因工程菌及其应用，属于基因工程技术领域。通过对信号肽进行改造，筛选改造后的信号肽，获得1个信号肽，序列如SEQIDN0.1所示。构建枯草芽孢杆菌纳豆激酶高表达菌株，能够提高蛋白酶活力。CN115948309ACN115948309A权利要求书1/1页1.一种生产纳豆激酶的重组基因工程菌，其特征在于，所述重组基因工程菌为在枯草芽孢杆菌WB800中转入重组质粒获得，所述重组质粒包括如SEQIDN0.1所示的信号肽的基因和如SEQIDN0.7所示的来源于枯草芽孢杆菌N2的纳豆激酶基因，所述信号肽的基因融合到所述纳豆激酶基因的N端。2.权利要求1所述重组基因工程菌在生产纳豆激酶中的应用。2CN115948309A说明书1/6页生产纳豆激酶的重组基因工程菌及其应用[0001]声明：本发明是在2022年3月30号申请的专利号2022103268312_、专利名称“一种用于提高纳豆激酶分泌效率的信号肽及其应用”基础上的分案。_技术领域[0002]本发明涉及一种生产纳豆激酶的重组基因工程菌及其应用，属于基因工程技术领域。背景技术[0003]纳豆激酶(Nattokinase，NK，EC3.4.21.62)是在纳豆发酵过程中，其中的纳豆芽孢杆菌利用黄豆中的营养，发酵产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶。该酶因其高效安全的溶栓能力，在心脑血管疾病领域掀起研究热潮。在此之前，常用临床溶栓药物主要有链激酶、尿激酶和纤维酶原激活因子等，但此类药物存在成本高昂、安全性低且药效短等弊端，不宜进行规模化生产。纳豆激酶无论在成本还是安全性方面均有显著优势，特别是它可直接作用于纤维蛋白，大大提高溶栓效率，使其与上述溶栓药物相比具有独特优越性和广阔开发前景。此外，纳豆激酶被证实在血压血脂调节方面有显著效果，且在抗疲劳、抗菌、抗氧化、调节内分泌等方面有研究价值，是一种高潜力的膳食补充剂，在食品工业上具有较大开发意义。[0004]Nakamura等人(1992)通过当时较为精确的鸟枪法首次克隆了纳豆激酶基因，并对其一级结构进行深入解析，测定了该酶的全基因序列，从此科研工作者开始从分子水平，利用基因工程手段对纳豆激酶基因或其宿主进行改造和优化。刘北域等人从纳豆芽孢杆菌中钓取纳豆激酶原基因，于E.coliJF1125中构建温度诱导型表达质粒pESX‑1，实现了纳豆激酶在大肠杆菌中的有效表达。除此之外，其余宿主，例如毕赤酵母(Pichiapastoris)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)以及草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)等均实现了纳豆激酶的有效表达。[0005]为了提高纳豆激酶外源表达水平，研究者在表达元件优化上也开展了多项工作。例如Wu等人尝试用启动子(Paprv)启动纳豆激酶的转录表达，并通过点突变改造其核心‑35和‑10序列，发现‑10区的突变改造使酶活提高了1.36倍。在分子水平上改造原始基因及其关键元件，可能显著提高纳豆激酶酶活力。发明内容[0006]本发明要解决的技术问题在于提供一种生产纳豆激酶的重组基因工程菌及其应用，通过对信号肽进行改造，筛选改造后的信号肽，优化纳豆激酶蛋白表达框，构建枯草芽孢杆菌纳豆激酶高表达菌株，提高蛋白酶活力。[0007]本发明是通过如下技术方案来实现的：[0008]一种生产纳豆激酶的重组基因工程菌，所述重组基因工程菌为在枯草芽孢杆菌WB800中转入重组质粒获得，所述重组质粒包括如SEQIDN0.1所示的信号肽的基因和如3CN115948309A说明书2/6页SEQIDN0.7所示的来源于枯草芽孢杆菌N2的纳豆激酶基因，所述信号肽的基因融合到所述纳豆激酶基因的N端。[0009]本发明还提供所述重组