超滤亲和—液质联用技术筛选中药抗凝血酶活性成分研究.doc

超滤亲和—液质联用技术筛选中药抗凝血酶活性成分研究目的:凝血酶是抗凝血的重要靶点,新型口服抗凝药直接作用于凝血酶发挥抗凝作用。新型口服抗凝药具有出血、缺乏特异对抗剂、漏服发生严重并发症等严重不良反应。丹参作为活血化瘀最常用的中药,目前研究表明其成分具有较强的抗凝血作用,当归常与丹参配伍的用作活血抗凝,因此选择丹参和当归作为超滤亲和筛选对象。本文拟建立超滤亲和凝血酶抑制剂筛选方法,快速高通量筛选中药中抗凝血酶成分。对丹参、当归的成分进行凝血酶结合后的超滤筛选,并通过质谱进行鉴定和抗凝血活性测定确定抗凝血酶活性成分。而后通过活性验证及等温滴定量热技术对丹参和当归中抗凝血酶活性成分进行机制研究,以期确认其抗凝活性并探究其抗凝血酶机制。方法:1.建立基于超滤亲和技术的抗凝血酶活性成分筛选方法,考察不同孵育时间及孵育温度对方法的影响,并考察凝血酶的溶剂耐受性。2.通过UPLC法分离丹参、当归的醇提物和水提物,建立其指纹图谱。3.通过UPLC-LTQ-Obitrap-MSn质谱仪对丹参、当归成分进行鉴定,而后通过建立的超滤亲和筛选方法对丹参、当归进行抗凝血酶活性成分筛选。4.通过生色底物法验证筛选成分的抗凝血酶活性并通过等温滴定量热仪(ITC)测定潜在抗凝血酶活性成分与凝血酶的滴定曲线,分析热力学参数,并探讨潜在活性成分的作用机制。结果:1.本文成功建立超滤亲和抗凝血酶活性成分筛选方法,经考察,确定孵育条件为37℃下孵育40min。灭活凝血酶对丹酚酸A无结合,证明凝血酶虽然与配体不存在非特异性结合,特异性的结合占主要地位。凝血酶具有较好的溶剂耐受性,在30%DMSOPBS溶液和60%甲醇中能保持50min稳定的活性。2.建立了丹参水提物和醇提物及当归水提物和醇提物的UPLC分离方法,结果显示所有分离良好,样品溶液各色谱峰面积及保留时间均无显著性差异,重复性良好。3.本文在丹参水提物、丹参醇提物、当归水提物、当归醇提物中分别筛选9、9、4、7个潜在抗凝血酶活性成分。结合标准品、reayxs数据库、ETCM数据库及相关参考文献比对,指认了丹参水提物中26个成分,丹参醇提物中22个成分,当归水提物中24个成分、当归醇提物中45个成分,为超滤亲和筛选后的成分确定提供基础,同时为丹参、当归的物质研究提供的新的基础。4.经活性验证实验,确定了丹参素、β熊果苷、丹酚酸D、二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、欧当归内酯A、洋川芎内酯Ⅰ具有抗凝血酶活性,α熊果苷不具有抗凝血酶活性,确证了方法的可靠性。等温滴定量热法测定丹酚酸D与凝血酶的结合为离子键结合,揭示了凝血酶与潜在活性成分可能的作用方式。结论:本研究为从复杂的天然药物中寻找抗凝血酶活性成分提供了可靠的筛选方法;为其他酶的抑制剂筛选提供了新的思路;为非水溶性化合物的超滤亲和筛选方法提供了新思路;为小分子药物与酶等生物大分子的相互作用研究提供了有效方法;同时对于丹参、当归抗凝血酶活性的物质基础研究提供了参考和依据。