大豆抗原蛋白对仔猪肠道功能的影响及自噬机制的研究.doc

大豆抗原蛋白对仔猪肠道功能的影响及自噬机制的研究大豆抗原蛋白可诱导仔猪腹泻,但相关机制仍不清楚。本论文研究了伴大豆球蛋白对仔猪小肠上皮细胞和仔猪肠道生长、转运通道、屏障功能和自噬活性等相关基因与蛋白相对表达量的影响,分别从体外细胞试验和体内动物试验来研究伴大豆球蛋白的作用机制。1伴大豆球蛋白对IPEC-1细胞生长与活力的影响将IPEC-1细胞分成6个处理组:对照组、5个不同浓度梯度伴大豆球蛋白(0.28mg/mL、0.56mg/mL、1.11mg/mL、2.23mg/mL和4.45mg/mL)的处理组,研究不同水平的伴大豆球蛋白对IPEC-1细胞生长与活力的影响。结果显示,随着添加伴大豆球蛋白浓度的上升,IPEC-1细胞活力下降,且对细胞的半数毒性浓度(TC50)为1.20mg/mL。2伴大豆球蛋白对IPEC-1细胞增殖、转运通道、屏障功能等相关基因和蛋白表达的影响将IPEC-1细胞分成2个处理组:对照组、1.20mg/mL伴大豆球蛋白组,每天换液,3天后提取细胞的总RNA和总蛋白,分别测定IPEC-1细胞增殖、转运通道、屏障功能等相关基因和蛋白的表达量。结果表明:(1)伴大豆球蛋白降低了细胞转运通道基因CFTR、SGLT-1、AQP3、AQP4和Claudin-1的mRNA水平(P<0.05),但提高了Bcl-2、Bcl-xl、PepT1、AQP10、Occludin和ZO-1的mRNA水平(P<0.05)。(2)伴大豆球蛋白提高了IPEC-1细胞AQP4、Bcl-2和caspase-3的蛋白表达量。3伴大豆球蛋白对IPEC-1细胞自噬活性的影响(1)将GFP-LC3转染的IPEC-1细胞分成2个处理组:对照组、1.20mg/mL的伴大豆球蛋白组。每天换液,3天后制作细胞切片并进行自噬斑观测,研究大豆抗原蛋白对GFP-LC3-IPEC-1细胞自噬斑的影响。(2)将IPEC-1细胞分成2个处理组:对照组、1.20mg/mL的伴大豆球蛋白组,每天换液,3天后提取培养细胞的总蛋白,测定蛋白LC3-I和LC3-II的表达量,研究大豆抗原蛋白对IPEC-1细胞中蛋白LC3-I和LC3-II的表达量影响。(3)将GFP-LC3转染的IPEC-1细胞分成6个处理组:对照组、1.20mg/mL伴大豆球蛋白组、8.9nM巴弗洛霉素组、100nM渥曼青霉素组、1.20mg/mL伴大豆球蛋白+8.9nM巴弗洛霉素组、1.20mg/mL伴大豆球蛋白+100nM渥曼青霉素组。每天换液,3天后制作细胞爬片进行自噬斑观测试验,研究自噬抑制剂对伴大豆球蛋白诱导的细胞自噬斑的影响。(4)将IPEC-1细胞分成6个处理组:对照组、1.20mg/mL伴大豆球蛋白组、8.9nM巴弗洛霉素组、100nM渥曼青霉素组、1.20mg/mL伴大豆球蛋白+8.9nM巴弗洛霉素组、1.20mg/mL伴大豆球蛋白+100nM渥曼青霉素组。每天换液,3天后提取细胞的总蛋白,测定蛋白LC3-I和LC3-II的表达量,研究自噬抑制剂对伴大豆球蛋白诱导的IPEC-1细胞中自噬相关蛋白LC3-I和LC3-II的表达量影响。结果显示:(1)伴大豆球蛋白可诱导GFP-LC3-IPEC-1细胞自噬斑增多。(2)伴大豆球蛋白提高了LC3-II的表达量,导致LC3-II/LC3-I比值显著上升(P<0.05)。(3)当加入自噬抑制剂后,伴大豆球蛋白的GFP-LC3转染的IPEC-1细胞自噬斑显著减少(P<0.05),但LC3-II/LC3-I比值有上升趋势。因此,伴大豆球蛋白可能诱导IPEC-1细胞自噬活性增强。4伴大豆球蛋白对仔猪的生长性能及肠道形态和功能基因与蛋白表达的影响试验选用21日龄(杜×长×大)仔猪12头,随机分成2个处理组:对照组(饲喂含4%酪蛋白的基础日粮)和伴大豆球蛋白组(饲喂含4%伴大豆球蛋白的基础日粮)。试验为期8天,采血后屠宰,取十二指肠、空肠、回肠和结肠等组织样品。结果表明:(1)日粮中添加伴大豆球蛋白降低了仔猪的日增重,提高了仔猪料肉比和腹泻率。(2)伴大豆球蛋白提高了仔猪十二指肠、空肠和结肠的隐窝深度,降低了十二指肠的绒毛宽度、回肠的绒毛高度和绒毛面积。(3)在日粮中添加伴大豆球蛋白提高了仔猪十二指肠的CFTR和MMP4mRNA水平,但降低了AQP3、Villin、MMP3的相对表达量;空肠相关研究结果表明,伴大豆球蛋白提高了Bcl-2、CFTR、PepT1、SGLT-1、NHE3、AQP3、AQP4、AQP8和Occludin的相对表达量,但下调了AQP10的表达;回肠相关研究结果表明,伴大豆球蛋白提高了PepT1和Occludin的mRNA水平,但下调了Bax、AQP3、Villin和MMP3基因的相对表达量。(4)伴大豆球蛋白显著降低了仔