草莓茎尖超低温疗法脱毒技术体系的建立.doc

草莓茎尖超低温疗法脱毒技术体系的建立草莓(Fragaria×ananassaDuch.)是蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)多年生草本植物。其果实鲜嫩多汁、色泽艳丽、香气怡人、口感酸甜适中,是我国传统的优秀浆果果品之一。其繁殖主要采用传统的分株繁殖或匍匐茎埋压,这种无性繁殖的方式提高了病毒侵染植株的几率。避免病毒给生产带来巨大的经济损失,实现草莓无病毒苗栽培生产化,必将是我国草莓业目前势在必行的发展趋势和目标。而超低温疗法是一种新型、高效脱除植物病毒的新技术,备受各研究科学者的亲睐。本试验以‘红颜’草莓(Fragaria×ananassaDuch.cv.Benihoppe)品种大田茎尖为试验材料,对超低温疗法关键程序(预培养、预处理和化冻条件)进行了筛选和优化,并以茎尖脱毒法为对照,建立起完善的超低温疗法脱毒技术体系。在此基础上,研究者对多重RT-PCR病毒检测体系相关参数(Mg2+浓度、引物浓度、PCR程序等)进行了优化和改进,以期建立完善的多重RT-PCR病毒检测体系。最后利用DNA相关软件筛选分析SSR-PCR引物,分析超低温疗法脱毒苗遗传性状的稳定性,实验结果如下：1.适合‘红颜’草莓苗的超低温疗法脱毒技术体系为：在含0.3mo.L一预培养基上暗培养7d,室温下LS装载60min,0℃下PVS2脱水1h,液氮处理1h,40℃水浴化冻120s,用含1.2mol·L-1蔗糖的液体MS培养基洗涤两次,每次10mmin。该体系同时脱除草莓四种主要病毒(草莓镶脉病毒、草莓轻型黄边病毒、草莓皱缩病毒和草莓斑驳病毒)的比率高达100%,成活率为69.03%。将该体系再用于‘蜀丰’‘丰香’以及‘章姬’,其存活率分别为68.15%、71.00%和69.78%,达到预期的试验目标。2.适用于多重RT-PCR检测体系的引物是SC1/SC2、SM1/SM2、SY1/SY2、SV1/SV2、A1/A2,目的片段大小分别是345bp、394bp、861bp、271bp和295bp；多重RT-PCR病毒检测体系是1μlcDNA、2μl10×PCRbufer、2.0mmol·L-1MgCl2、0.2mmol·L-1dNTPs、0.5UTaq酶,引物浓度0.2μmol·L-1(SCV0.25μmol·L/1),最后用超纯水补至20μl;PCR程序：94℃预变性3min,94℃变性1min,55℃退火40s,68℃延伸40s,35个循环,72℃再延伸5min。